Özet

Создание самособирающихся органоидов человеческого сердца, полученных из плюрипотентных стволовых клеток

Published: September 15, 2021
doi:

Özet

Здесь мы описываем протокол для создания органоидов сердца человека (hHO), имеющих отношение к развитию, эффективно используя плюрипотентные стволовые клетки человека путем самоорганизации. Протокол опирается на последовательную активацию сигналов развития и производит очень сложные, функционально значимые ткани сердца человека.

Abstract

Способность изучать развитие сердца человека в области здоровья и болезней сильно ограничена способностью моделировать сложность человеческого сердца in vitro. Разработка более эффективных органоподобных платформ, которые могут моделировать сложные фенотипы in vivo , такие как органоиды и органы на чипе, повысит способность изучать развитие сердца и болезни человека. В этой статье описывается протокол генерации очень сложных органоидов сердца человека (hHO) путем самоорганизации с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека и ступенчатой активации путей развития с использованием ингибиторов малых молекул. Эмбриоидные тела (ЭБ) генерируются в 96-луночной пластине с круглодонными, сверхнизкими прикрепленными колодцами, что облегчает культуру суспензии индивидуализированных конструкций.

ЭБ подвергаются дифференцировке в hHO с помощью трехступенчатой стратегии модуляции сигналов Wnt, которая включает в себя начальную активацию пути Wnt, чтобы вызвать судьбу сердечной мезодермы, второй шаг ингибирования Wnt для создания окончательных сердечных линий и третий шаг активации Wnt для индуцирования тканей проэпикардиальных органов. Эти этапы, выполненные в формате 96 лунок, являются высокоэффективными, воспроизводимыми и производят большое количество органоидов за прогон. Анализ с помощью иммунофлуоресцентной визуализации с 3 по 11 день дифференцировки выявляет особенности первого и второго полей сердца и очень сложные ткани внутри hHO на 15-й день, включая ткань миокарда с областями предсердных и желудочковых кардиомиоцитов, а также внутренние камеры, выстланные тканью эндокарда. Органоиды также демонстрируют сложную сосудистую сеть по всей структуре и внешнюю оболочку эпикардиальной ткани. С функциональной точки зрения hHO уверенно бьются и представляют нормальную активность кальция, как определено с помощью живой визуализации Fluo-4. В целом, этот протокол представляет собой прочную платформу для исследований in vitro в органоподобных сердечных тканях человека.

Introduction

Врожденные пороки сердца (ИБС) являются наиболее распространенным типом врожденных дефектов у людей и затрагивают примерно 1% всех живорождений1,2,3. В большинстве случаев причины ИБС остаются неизвестными. Способность создавать модели человеческого сердца в лаборатории, которые очень похожи на развивающееся человеческое сердце, представляет собой значительный шаг вперед для непосредственного изучения основных причин ИБС у людей, а не у суррогатных животных моделей.

Воплощением лабораторно выращенных моделей тканей являются органоиды, 3D-клеточные конструкции, которые напоминают орган, представляющий интерес по клеточному составу и физиологической функции. Органоиды часто получают из стволовых клеток или клеток-предшественников и успешно используются для моделирования многих органов, таких как мозг4,5, почки6,7, кишечник8,9, легкие10,11, печень12,13 и поджелудочная железа14,15 , и это лишь некоторые из них. Появились недавние исследования, демонстрирующие целесообразность создания самособирающихся сердечных органоидов для изучения развития сердца in vitro. Эти модели включают использование эмбриональных стволовых клеток мышей (mESCs) для моделирования раннего развития сердца16,17 до атриовентрикулярной спецификации18 и плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) для генерации органоидов сердечно-эндодермы с несколькими зародышевыми слоями19 и камерных кардиоидов20 с очень сложным клеточным составом.

В этой статье представлен новый 3-ступенчатый протокол модуляции WNT для создания очень сложных hHO эффективным и экономичным способом. Органоиды генерируются в 96-луночных пластинах, что приводит к масштабируемой, высокопроизводительной системе, которая может быть легко автоматизирована. Этот метод основан на создании агрегатов hPSC и запуске этапов развития кардиогенеза, включая формирование мезодермы и сердечной мезодермы, спецификацию первого и второго поля сердца, формирование проэпикардиальных органов и атриовентрикулярную спецификацию. После 15 дней дифференцировки hHO содержат все основные клеточные линии, обнаруженные в сердце, четко определенные внутренние камеры, предсердные и желудочковые камеры и сосудистую сеть по всему органоиду. Эта очень сложная и воспроизводимая органоидная система сердца поддается исследованию структурных, функциональных, молекулярных и транскриптомных анализов при изучении развития сердца, заболеваний и фармакологического скрининга.

Protocol

1. Культура и обслуживание hPSC ПРИМЕЧАНИЕ: Индуцированные человеком PSC (hiPSCs) или эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) необходимо культивировать в течение по крайней мере 2 последовательных проходов после оттаивания, прежде чем их использовать для генерации ЭБ для д?…

Representative Results

Для достижения самоорганизующегося hHO in vitro мы модифицировали и комбинировали протоколы дифференцировки, ранее описанные для 2D-монослойной дифференцировки кардиомиоцитов21 и эпикардиальных клеток22 с использованием модуляторов пути Wnt и для 3D-прекардиал?…

Discussion

Последние достижения в области кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток человека, и других клеток сердечного происхождения были использованы для моделирования развития сердца человека22,24,25 и болезней26,27,28 и в качестве инструме?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным институтом сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения под номерами K01HL135464 и R01HL151505 и Американской кардиологической ассоциацией под номером 19IPLOI34660342. Мы хотим поблагодарить MSU Advanced Microscopy Core и доктора Уильяма Джексона на кафедре фармакологии и токсикологии МГУ за доступ к конфокальным микроскопам, IQ Microscopy Core и MSU Genomics Core за услуги секвенирования. Мы также хотели бы поблагодарить всех членов Лаборатории Агирре за их ценные замечания и советы.

Materials

Antibodies
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse Invitrogen A-21202 1:200
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit Invitrogen A-21206 1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse Invitrogen A-21203 1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit Invitrogen A-21207 1:200
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat Invitrogen A32849 1:200
HAND1 Abcam ab196622 Rabbit; 1:200
HAND2 Abcam ab200040 Rabbit; 1:200
NFAT2 Abcam ab25916 Rabbit; 1:100
PECAM1 DSHB P2B1 Rabbit; 1:50
TNNT2 Abcam ab8295 Mouse; 1:200
THY1 Abcam ab133350 Rabbit; 1:200
TJP1 Invitrogen PA5-19090 Goat; 1:250
VIM Abcam ab11256 Goat; 1:250
WT1 Abcam ab89901 Rabbit; 1:200
Media and Reagents
Accutase Innovative Cell Technologies NC9464543 cell dissociation reagent
Activin A R&D Systems 338AC010
B-27 Supplement (Minus Insulin) Gibco A1895601 insulin-free cell culture supplement
B-27 Supplement Gibco 17504-044 cell culture supplement
BMP-4 Gibco PHC9534
Bovine Serum Albumin Bioworld 50253966
CHIR-99021 Selleck 442310
D-(-)-Fructose Millipore Sigma F0127
DAPI Thermo Scientific 62248 1:1000
Dimethyl Sulfoxide Millipore Sigma D2650
DMEM/F12 Gibco 10566016
Essential 8 Flex Medium Kit Gibco A2858501 pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin
Fluo4-AM Invitrogen F14201
Glycerol Millipore Sigma G5516
Glycine Millipore Sigma 410225
Matrigel GFR Corning CB40230 Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)
Normal Donkey Serum Millipore Sigma S30-100mL
Paraformaldehyde MP Biomedicals IC15014601 Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4%
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffer Solution Gibco 10010049
Phosphate Buffer Solution (10x) Gibco 70011044
Polybead Microspheres Polysciences, Inc. 73155 90 µm
ReLeSR Stem Cell Technologies NC0729236 dissociation reagent for hPSCs
RPMI 1640 Gibco 11875093
Thiazovivin Millipore Sigma SML1045
Triton X-100 Millipore Sigma T8787
Trypan Blue Solution Gibco 1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H170010
WNT-C59 Selleck NC0710557
Diğer
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 02682002
15 mL Falcon Tubes Fisher Scientific 1495970C
2 mL Cryogenic Vials Corning 13-700-500
50 mL Reagent Reservoirs Fisherbrand 13681502
6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 0720083
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass Cellvis C8-1.5H-N
96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates Costar 07201680
ImageJ NIH Image processing software
Kimwipes Kimberly-Clark Professional 06-666 laboratory wipes
Micro Cover Glass VWR 48393-241 24 x 50 mm No. 1.5
Microscope Slides Fisherbrand 1255015
Moxi Cell Counter Orflo Technologies  MXZ001
Moxi Z Cell Count Cassette – Type M Orflo Technologies MXC001
Multichannel Pipettes Fisherbrand FBE1200300 30-300 µL
Olympus cellVivo Olympus For Caclium Imaging, analysis with Imagej
Sorvall Legend X1 Centrifuge ThermoFisher Scientific 75004261
Thermoshaker ThermoFisher Scientific 13-687-711PM
Top Coat Nail Varish Seche Vite Can purchase from any supermarket

Referanslar

  1. Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
  2. Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Tıp. 99 (23), 20593 (2020).
  3. Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  6. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  7. Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
  8. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569, 66-72 (2019).
  9. Mithal, A., et al. Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 11, 215 (2020).
  10. Porotto, M., et al. Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids. mBio. 10 (3), 00723 (2019).
  11. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, 05098 (2015).
  12. Mun, S. J., et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).
  13. Vyas, D., et al. Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro. Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).
  14. Dossena, M., et al. Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11, 94 (2020).
  15. Georgakopoulos, N., et al. Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids. BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).
  16. Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9, 3140 (2018).
  17. Rossi, G., et al. Capturing cardiogenesis in gastruloids. Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).
  18. Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).
  19. Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).
  20. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).
  21. Bao, X., et al. Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions. Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).
  22. Bao, X., et al. Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions. Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).
  23. Lewis-Israeli, Y., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12, 5142 (2021).
  24. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  25. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  26. Hashem, S. I., et al. Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).
  27. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  28. Stroud, M. J., et al. Luma is not essential for murine cardiac development and function. Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).
  29. Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
  30. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).
  31. Braam, S. R., et al. Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).
  32. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  33. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).
  34. Bertero, A., et al. Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory. Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).
  35. Gilbert, S. F. Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System. Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).
  36. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
  37. Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease. Biomolecules. 1277, (2021).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Lewis-Israeli, Y. R., Volmert, B. D., Gabalski, M. A., Huang, A. R., Aguirre, A. Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (175), e63097, doi:10.3791/63097 (2021).

View Video