Özet

יצירת אורגנוידים של לב אנושי המורכבים בעצמם המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים

Published: September 15, 2021
doi:

Özet

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנוידים לב אנושי רלוונטיים להתפתחות (hHOs) ביעילות באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים על ידי ארגון עצמי. הפרוטוקול מסתמך על הפעלה רציפה של רמזים התפתחותיים ומייצר רקמות לב אנושיות מורכבות ורלוונטיות מאוד מבחינה תפקודית.

Abstract

היכולת לחקור את התפתחות הלב האנושי בבריאות ובמחלות מוגבלת מאוד על ידי היכולת לדגמן את המורכבות של הלב האנושי במבחנה. פיתוח פלטפורמות יעילות יותר דמויי איברים שיכולות לדגמן פנוטיפים מורכבים ב- vivo , כגון organoids ואיברים על שבב, ישפר את היכולת לחקור התפתחות הלב האנושי ומחלות. מאמר זה מתאר פרוטוקול ליצירת אורגנוידים מורכבים מאוד של הלב האנושי (hHOs) על ידי ארגון עצמי באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים והפעלה של מסלול התפתחותי צעד באמצעות מעכבי מולקולות קטנות. גופים עובריים (EBs) נוצרים בצלחת 96 באר עם בארות התקשרות עגולות, אולטרה נמוכות, המקלה על תרבות ההשעיה של מבנים בודדים.

ה- EBs עוברים בידול ל- hHOs על ידי אסטרטגיית אפנון איתות Wnt בת שלושה שלבים, הכוללת הפעלת מסלול Wnt ראשונית כדי לגרום לגורל mesoderm לב, צעד שני של עיכוב Wnt כדי ליצור שושלות לב מוחלטות, וצעד הפעלה Wnt שלישי כדי לגרום לרקמות איברים פרו-אפיקרדיאליים. שלבים אלה, המתבצעים בפורמט של 96 בארות, יעילים מאוד, ניתנים לשחזור ומייצרים כמויות גדולות של אורגנוידים לריצה. ניתוח על ידי הדמיית immunofluorescence מהיום 3 ליום 11 של בידול מגלה מפרט שדה הלב הראשון והשני ורקמות מורכבות מאוד בתוך hHOs ביום 15, כולל רקמת שריר הלב עם אזורים של cardiomyocytes פרזדורים וחדריים, כמו גם תאים פנימיים מרופדים ברקמת אנדוקרדית. האורגנוידים מציגים גם רשת כלי דם מורכבת בכל המבנה ובטנה חיצונית של רקמה אפיקרדיאלית. מנקודת מבט פונקציונלית, hHOs להכות בחוזקה ולהציג פעילות סידן נורמלית כפי שנקבע על ידי Fluo-4 הדמיה חיה. בסך הכל, פרוטוקול זה מהווה פלטפורמה מוצקה למחקרי במבחנה ברקמות לב דמויי איברים אנושיים.

Introduction

מומים מולדים בלב (CHDs) הם הסוג הנפוץ ביותר של פגם מולד בבני אדם ומשפיעים על כ -1% מכלל הלידות החיות1,2,3. ברוב הנסיבות, הסיבות ל- CHDs עדיין אינן ידועות. היכולת ליצור מודלים של לב אנושי במעבדה הדומים מאוד ללב האנושי המתפתח מהווה צעד משמעותי קדימה כדי לחקור ישירות את הגורמים הבסיסיים של CHDs בבני אדם ולא במודלים של בעלי חיים פונדקאיים.

התגלמות מודלים של רקמות שגודלו במעבדה הם אורגנוידים, מבני תאים תלת-ממדיים הדומים לאיבר בעל עניין בהרכב התא ובתפקוד הפיזיולוגי. אורגנואידים נגזרים לעתים קרובות מתאי גזע או מתאי אבות ונעשה בהם שימוש מוצלח לדגמן איברים רבים כגון המוח4,5, כליות6,7, מעיים8,9, ריאה10,11, כבד12,13 ולבלב14,15 רק כדי להזכיר כמה., מחקרים אחרונים הופיעו מדגים את ההיתכנות של יצירת organoids לב להרכיב עצמית ללמוד התפתחות הלב במבחנה. מודלים אלה כוללים שימוש בתאי גזע עובריים של עכבר (mESCs) כדי לדגמן פיתוח לב מוקדם16,17 עד מפרט atrioventricular18 ותאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים (hPSCs) כדי ליצור organoids לב-אנדודרם שכבת רב-נבט19 וקרדיואידים תאיים20 עם הרכב תאי מורכב מאוד.

מאמר זה מציג פרוטוקול אפנון WNT חדשני בן 3 שלבים כדי ליצור hHOs מורכבים מאוד באופן יעיל וחסכוני. Organoids נוצרים לוחות 96-well, וכתוצאה מכך מערכת מדרגית, תפוקה גבוהה שניתן להפוך לאוטומטית בקלות. שיטה זו מסתמכת על יצירת אגרגטים hPSC והפעלת צעדים התפתחותיים של cardiogenesis, כולל היווצרות mesoderm ו mesoderm לב, מפרט שדה הלב הראשון והשני, היווצרות איברים proepicardial, מפרט atrioventricular. לאחר 15 ימים של בידול, hHOs מכילים את כל שושלות התא העיקריות שנמצאו בלב, תאים פנימיים מוגדרים היטב, תאי פרזדורים וחדריים, ורשת כלי דם ברחבי האורגנויד. מערכת אורגנויד לב מתוחכמת ורבייה זו מקובלת לחקור ניתוחים מבניים, פונקציונליים, מולקולריים ותעתיקומיים בחקר התפתחות הלב, מחלות, והקרנה פרמקולוגית.

Protocol

1. תרבות ותחזוקה של hPSC הערה: מחשבי PC המושרה האנושי (hiPSCs) או תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) צריכים להיות מתורבתים לפחות 2 מעברים רצופים לאחר הפשרה לפני השימוש כדי ליצור EBs עבור בידול או הזעקה נוספת. h hPSCs מתורבתים במדיום PSC (ראה טבלת החומרים) על מטריצה חוץ-תאית במרתף (BM-ECM) מצו?…

Representative Results

כדי להשיג ארגון עצמי hHO במבחנה, שינינו ושילבנו פרוטוקולי בידול שתוארו בעבר עבור הבחנה דו-שכבתית של קרדיומיוציטים21 ותאים אפיקרדיים22 באמצעות אפננים מסלול Wnt עבור 3D אורגנוידים טרום לב16 באמצעות גורמי גדילה BMP4 ו Activin A. באמצעות לוח 96-well EB ו- hHO פרוטוקול בידול המתואר…

Discussion

ההתקדמות האחרונה בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע אנושיים ובתאים אחרים ממוצא לבבי שימשו למודל התפתחות הלב האנושי22,24,25 ומחלות26,27,28 וכלים לבדיקת טיפולים29,30</sup…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מכון הלב, הריאות והדם הלאומי של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי הפרסים K01HL135464 ו- R01HL151505 ועל ידי איגוד הלב האמריקאי תחת פרס מספר 19IPLOI3660342. אנו מבקשים להודות לליבת המיקרוסקופיה המתקדמת של MSU וד”ר ויליאם ג’קסון במחלקת MSU לפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה על גישה למיקרוסקופים קונפוקליים, לליבת המיקרוסקופיה של IQ ולליבה הגנומית של MSU עבור שירותי רצף. אנו גם רוצים להודות לכל חברי מעבדת אגירה על הערותיהם ועצותיהם החשובות.

Materials

Antibodies
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse Invitrogen A-21202 1:200
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit Invitrogen A-21206 1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse Invitrogen A-21203 1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit Invitrogen A-21207 1:200
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat Invitrogen A32849 1:200
HAND1 Abcam ab196622 Rabbit; 1:200
HAND2 Abcam ab200040 Rabbit; 1:200
NFAT2 Abcam ab25916 Rabbit; 1:100
PECAM1 DSHB P2B1 Rabbit; 1:50
TNNT2 Abcam ab8295 Mouse; 1:200
THY1 Abcam ab133350 Rabbit; 1:200
TJP1 Invitrogen PA5-19090 Goat; 1:250
VIM Abcam ab11256 Goat; 1:250
WT1 Abcam ab89901 Rabbit; 1:200
Media and Reagents
Accutase Innovative Cell Technologies NC9464543 cell dissociation reagent
Activin A R&D Systems 338AC010
B-27 Supplement (Minus Insulin) Gibco A1895601 insulin-free cell culture supplement
B-27 Supplement Gibco 17504-044 cell culture supplement
BMP-4 Gibco PHC9534
Bovine Serum Albumin Bioworld 50253966
CHIR-99021 Selleck 442310
D-(-)-Fructose Millipore Sigma F0127
DAPI Thermo Scientific 62248 1:1000
Dimethyl Sulfoxide Millipore Sigma D2650
DMEM/F12 Gibco 10566016
Essential 8 Flex Medium Kit Gibco A2858501 pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin
Fluo4-AM Invitrogen F14201
Glycerol Millipore Sigma G5516
Glycine Millipore Sigma 410225
Matrigel GFR Corning CB40230 Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)
Normal Donkey Serum Millipore Sigma S30-100mL
Paraformaldehyde MP Biomedicals IC15014601 Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4%
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffer Solution Gibco 10010049
Phosphate Buffer Solution (10x) Gibco 70011044
Polybead Microspheres Polysciences, Inc. 73155 90 µm
ReLeSR Stem Cell Technologies NC0729236 dissociation reagent for hPSCs
RPMI 1640 Gibco 11875093
Thiazovivin Millipore Sigma SML1045
Triton X-100 Millipore Sigma T8787
Trypan Blue Solution Gibco 1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H170010
WNT-C59 Selleck NC0710557
Diğer
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 02682002
15 mL Falcon Tubes Fisher Scientific 1495970C
2 mL Cryogenic Vials Corning 13-700-500
50 mL Reagent Reservoirs Fisherbrand 13681502
6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 0720083
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass Cellvis C8-1.5H-N
96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates Costar 07201680
ImageJ NIH Image processing software
Kimwipes Kimberly-Clark Professional 06-666 laboratory wipes
Micro Cover Glass VWR 48393-241 24 x 50 mm No. 1.5
Microscope Slides Fisherbrand 1255015
Moxi Cell Counter Orflo Technologies  MXZ001
Moxi Z Cell Count Cassette – Type M Orflo Technologies MXC001
Multichannel Pipettes Fisherbrand FBE1200300 30-300 µL
Olympus cellVivo Olympus For Caclium Imaging, analysis with Imagej
Sorvall Legend X1 Centrifuge ThermoFisher Scientific 75004261
Thermoshaker ThermoFisher Scientific 13-687-711PM
Top Coat Nail Varish Seche Vite Can purchase from any supermarket

Referanslar

  1. Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
  2. Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Tıp. 99 (23), 20593 (2020).
  3. Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  6. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  7. Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
  8. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569, 66-72 (2019).
  9. Mithal, A., et al. Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 11, 215 (2020).
  10. Porotto, M., et al. Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids. mBio. 10 (3), 00723 (2019).
  11. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, 05098 (2015).
  12. Mun, S. J., et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).
  13. Vyas, D., et al. Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro. Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).
  14. Dossena, M., et al. Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11, 94 (2020).
  15. Georgakopoulos, N., et al. Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids. BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).
  16. Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9, 3140 (2018).
  17. Rossi, G., et al. Capturing cardiogenesis in gastruloids. Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).
  18. Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).
  19. Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).
  20. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).
  21. Bao, X., et al. Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions. Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).
  22. Bao, X., et al. Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions. Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).
  23. Lewis-Israeli, Y., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12, 5142 (2021).
  24. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  25. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  26. Hashem, S. I., et al. Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).
  27. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  28. Stroud, M. J., et al. Luma is not essential for murine cardiac development and function. Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).
  29. Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
  30. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).
  31. Braam, S. R., et al. Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).
  32. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  33. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).
  34. Bertero, A., et al. Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory. Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).
  35. Gilbert, S. F. Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System. Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).
  36. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
  37. Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease. Biomolecules. 1277, (2021).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Lewis-Israeli, Y. R., Volmert, B. D., Gabalski, M. A., Huang, A. R., Aguirre, A. Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (175), e63097, doi:10.3791/63097 (2021).

View Video