Özet

Het genereren van zelfassemblerende organoïden voor het menselijk hart afgeleid van pluripotente stamcellen

Published: September 15, 2021
doi:

Özet

Hier beschrijven we een protocol om ontwikkelingsrelevante menselijke hartorganoïden (hHO’s) efficiënt te maken met behulp van menselijke pluripotente stamcellen door zelforganisatie. Het protocol is gebaseerd op de sequentiële activering van ontwikkelingssignalen en produceert zeer complexe, functioneel relevante menselijke hartweefsels.

Abstract

Het vermogen om de ontwikkeling van het menselijk hart in gezondheid en ziekte te bestuderen, wordt sterk beperkt door het vermogen om de complexiteit van het menselijk hart in vitro te modelleren. Het ontwikkelen van efficiëntere orgaanachtige platforms die complexe in vivo fenotypen kunnen modelleren, zoals organoïden en organen-op-een-chip, zal het vermogen om de ontwikkeling en ziekte van het menselijk hart te bestuderen verbeteren. Dit artikel beschrijft een protocol om zeer complexe menselijke hartorganoïden (hHO’s) te genereren door zelforganisatie met behulp van menselijke pluripotente stamcellen en stapsgewijze ontwikkelingswegactivering met behulp van kleine molecuulremmers. Embryoïde lichamen (EB’s) worden gegenereerd in een 96-well plaat met ronde bodem, ultra-lage bevestigingsputten, waardoor de suspensiecultuur van geïndividualiseerde constructies wordt vergemakkelijkt.

De EB’s ondergaan differentiatie in hHO’s door een driestaps Wnt-signaleringsmodulatiestrategie, die een initiële Wnt-routeactivering omvat om het lot van het cardiale mesoderm te induceren, een tweede stap van Wnt-remming om definitieve cardiale afstammingslijnen te creëren en een derde Wnt-activeringsstap om pro-epicardiale orgaanweefsels te induceren. Deze stappen, uitgevoerd in een 96-well formaat, zijn zeer efficiënt, reproduceerbaar en produceren grote hoeveelheden organoïden per run. Analyse door immunofluorescentie beeldvorming van dag 3 tot dag 11 van differentiatie onthult eerste en tweede hartveldspecificaties en zeer complexe weefsels in hHO’s op dag 15, inclusief myocardiaal weefsel met regio’s van atriale en ventriculaire cardiomyocyten, evenals interne kamers bekleed met endocardiaal weefsel. De organoïden vertonen ook een ingewikkeld vasculair netwerk door de hele structuur en een externe bekleding van epicardiaal weefsel. Vanuit functioneel oogpunt kloppen hHO’s robuust en vertonen ze een normale calciumactiviteit zoals bepaald door Fluo-4 live imaging. Over het algemeen vormt dit protocol een solide platform voor in vitro studies in menselijke orgaanachtige hartweefsels.

Introduction

Aangeboren hartafwijkingen (CHD’s) zijn het meest voorkomende type aangeboren afwijking bij de mens en treffen ongeveer 1% van alle levendgeborenen1,2,3. Onder de meeste omstandigheden blijven de redenen voor CHD’s onbekend. Het vermogen om menselijke hartmodellen in het laboratorium te maken die sterk lijken op het zich ontwikkelende menselijke hart, vormt een belangrijke stap voorwaarts om de onderliggende oorzaken van CHD’s bij mensen rechtstreeks te bestuderen in plaats van in surrogaatdiermodellen.

De belichaming van in het laboratorium gekweekte weefselmodellen zijn organoïden, 3D-celconstructies die lijken op een orgaan dat van belang is voor de celsamenstelling en fysiologische functie. Organoïden zijn vaak afgeleid van stamcellen of voorlopercellen en zijn met succes gebruikt om vele organen te modelleren, zoals de hersenen4,5, nier6,7, darm8,9, long10,11, lever12,13 tr pancreas14,15 , om er maar een paar te noemen. Recente studies zijn naar voren gekomen die de haalbaarheid aantonen van het creëren van zelfassemblerende hartorganoïden om de hartontwikkeling in vitro te bestuderen. Deze modellen omvatten het gebruik van embryonale stamcellen van muizen (mESCs) om vroege hartontwikkeling te modelleren16,17 tot atrioventriculaire specificatie18 en menselijke pluripotente stamcellen (hPSC’s) om multi-kiemlaag cardiale endoderm organoïden19 en gekamerde cardioïden20 met zeer complexe cellulaire samenstelling te genereren.

Dit artikel presenteert een nieuw 3-staps WNT-modulatieprotocol om zeer complexe hHO’s op een efficiënte en kosteneffectieve manier te genereren. Organoïden worden gegenereerd in 96-well platen, wat resulteert in een schaalbaar, high-throughput systeem dat eenvoudig kan worden geautomatiseerd. Deze methode is gebaseerd op het creëren van hPSC-aggregaten en het activeren van ontwikkelingsstappen van cardiogenese, waaronder mesoderm- en cardiale mesodermvorming, eerste en tweede hartveldspecificatie, pro-epicardiale orgaanvorming en atrioventriculaire specificatie. Na 15 dagen differentiatie bevatten hHO’s alle belangrijke cellijnen in het hart, goed gedefinieerde interne kamers, atriale en ventriculaire kamers en een vasculair netwerk in de organoïde. Dit zeer geavanceerde en reproduceerbare hartorganoïde systeem is vatbaar voor het onderzoeken van structurele, functionele, moleculaire en transcriptomische analyses in de studie van hartontwikkeling en ziekten en farmacologische screening.

Protocol

1. hPSC cultuur en onderhoud OPMERKING: De door de mens geïnduceerde PSC’s (hiPSC’s) of menselijke embryonale stamcellen (hESCs) moeten gedurende ten minste 2 opeenvolgende passages na het ontdooien worden gekweekt voordat ze worden gebruikt om EB’s te genereren voor differentiatie of verdere cryopreservatie. hPSC’s worden gekweekt in PSC-medium (zie de tabel met materialen) op keldermembraan-extracellulaire matrix (BM-ECM)-gecoate 6-well kweekplaten. Bij het uitvoeren van medi…

Representative Results

Om zelforganiserende hHO in vitro te bereiken, hebben we differentiatieprotocollen aangepast en gecombineerd die eerder zijn beschreven voor 2D-monolaagdifferentiatie van cardiomyocyten21 en epicardiale cellen22 met behulp van Wnt-routemodulatoren en voor 3D-precardiale organoïden16 met behulp van de groeifactoren BMP4 en Activine A. Met behulp van het 96-well plate EB- en hHO-differentiatieprotocol dat hier wordt beschreven en getoond in <…

Discussion

Recente ontwikkelingen in van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten en andere cellen van cardiale oorsprong zijn gebruikt om de ontwikkeling van het menselijk hart22,24,25 en ziekte26,27,28 te modelleren en als hulpmiddelen om therapeutica29,30 en toxische agentia <sup…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute van de National Institutes of Health onder de awardnummers K01HL135464 en R01HL151505 en door de American Heart Association onder awardnummer 19IPLOI34660342. We willen de MSU Advanced Microscopy Core en Dr. William Jackson van de MSU Department of Pharmacology and Toxicology bedanken voor toegang tot confocale microscopen, de IQ Microscopy Core en de MSU Genomics Core voor sequencingdiensten. We willen ook alle leden van het Aguirre Lab bedanken voor hun waardevolle opmerkingen en advies.

Materials

Antibodies
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse Invitrogen A-21202 1:200
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit Invitrogen A-21206 1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse Invitrogen A-21203 1:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit Invitrogen A-21207 1:200
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat Invitrogen A32849 1:200
HAND1 Abcam ab196622 Rabbit; 1:200
HAND2 Abcam ab200040 Rabbit; 1:200
NFAT2 Abcam ab25916 Rabbit; 1:100
PECAM1 DSHB P2B1 Rabbit; 1:50
TNNT2 Abcam ab8295 Mouse; 1:200
THY1 Abcam ab133350 Rabbit; 1:200
TJP1 Invitrogen PA5-19090 Goat; 1:250
VIM Abcam ab11256 Goat; 1:250
WT1 Abcam ab89901 Rabbit; 1:200
Media and Reagents
Accutase Innovative Cell Technologies NC9464543 cell dissociation reagent
Activin A R&D Systems 338AC010
B-27 Supplement (Minus Insulin) Gibco A1895601 insulin-free cell culture supplement
B-27 Supplement Gibco 17504-044 cell culture supplement
BMP-4 Gibco PHC9534
Bovine Serum Albumin Bioworld 50253966
CHIR-99021 Selleck 442310
D-(-)-Fructose Millipore Sigma F0127
DAPI Thermo Scientific 62248 1:1000
Dimethyl Sulfoxide Millipore Sigma D2650
DMEM/F12 Gibco 10566016
Essential 8 Flex Medium Kit Gibco A2858501 pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin
Fluo4-AM Invitrogen F14201
Glycerol Millipore Sigma G5516
Glycine Millipore Sigma 410225
Matrigel GFR Corning CB40230 Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM)
Normal Donkey Serum Millipore Sigma S30-100mL
Paraformaldehyde MP Biomedicals IC15014601 Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4%
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffer Solution Gibco 10010049
Phosphate Buffer Solution (10x) Gibco 70011044
Polybead Microspheres Polysciences, Inc. 73155 90 µm
ReLeSR Stem Cell Technologies NC0729236 dissociation reagent for hPSCs
RPMI 1640 Gibco 11875093
Thiazovivin Millipore Sigma SML1045
Triton X-100 Millipore Sigma T8787
Trypan Blue Solution Gibco 1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H170010
WNT-C59 Selleck NC0710557
Diğer
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 02682002
15 mL Falcon Tubes Fisher Scientific 1495970C
2 mL Cryogenic Vials Corning 13-700-500
50 mL Reagent Reservoirs Fisherbrand 13681502
6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 0720083
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass Cellvis C8-1.5H-N
96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates Costar 07201680
ImageJ NIH Image processing software
Kimwipes Kimberly-Clark Professional 06-666 laboratory wipes
Micro Cover Glass VWR 48393-241 24 x 50 mm No. 1.5
Microscope Slides Fisherbrand 1255015
Moxi Cell Counter Orflo Technologies  MXZ001
Moxi Z Cell Count Cassette – Type M Orflo Technologies MXC001
Multichannel Pipettes Fisherbrand FBE1200300 30-300 µL
Olympus cellVivo Olympus For Caclium Imaging, analysis with Imagej
Sorvall Legend X1 Centrifuge ThermoFisher Scientific 75004261
Thermoshaker ThermoFisher Scientific 13-687-711PM
Top Coat Nail Varish Seche Vite Can purchase from any supermarket

Referanslar

  1. Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
  2. Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Tıp. 99 (23), 20593 (2020).
  3. Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  6. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  7. Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
  8. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569, 66-72 (2019).
  9. Mithal, A., et al. Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 11, 215 (2020).
  10. Porotto, M., et al. Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids. mBio. 10 (3), 00723 (2019).
  11. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, 05098 (2015).
  12. Mun, S. J., et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).
  13. Vyas, D., et al. Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro. Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).
  14. Dossena, M., et al. Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11, 94 (2020).
  15. Georgakopoulos, N., et al. Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids. BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).
  16. Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9, 3140 (2018).
  17. Rossi, G., et al. Capturing cardiogenesis in gastruloids. Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).
  18. Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).
  19. Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).
  20. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).
  21. Bao, X., et al. Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions. Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).
  22. Bao, X., et al. Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions. Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).
  23. Lewis-Israeli, Y., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12, 5142 (2021).
  24. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  25. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  26. Hashem, S. I., et al. Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).
  27. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  28. Stroud, M. J., et al. Luma is not essential for murine cardiac development and function. Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).
  29. Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
  30. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).
  31. Braam, S. R., et al. Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).
  32. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  33. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).
  34. Bertero, A., et al. Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory. Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).
  35. Gilbert, S. F. Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System. Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).
  36. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
  37. Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease. Biomolecules. 1277, (2021).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Lewis-Israeli, Y. R., Volmert, B. D., Gabalski, M. A., Huang, A. R., Aguirre, A. Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (175), e63097, doi:10.3791/63097 (2021).

View Video