מאמר זה מתאר את השיטה להדמיה מיטוכונדריאלית של תרביות אסטרוציטים המצוידות בביו-סנסור MitoTimer ואת הניתוח הרב-פרמטרי המתקבל של דינמיקה מיטוכונדריאלית, ניידות, מורפולוגיה, ביוגנזה, מצב אדום ומחזור.
בעוד תשומת לב רבה ניתנה לשינויים מיטוכונדריאליים ברמה העצבית, הראיות האחרונות מדגימות כי דינמיקה מיטוכונדריאלית ותפקוד אסטרוציטים מעורבים בקוגניציה. מאמר זה מתאר את השיטה להדמיה בזמן-לשגות של תרביות אסטרוציטים המצוידות בביו-סנסור מיטוכונדריאלי: MitoTimer. MitoTimer הוא כלי רב עוצמה וייחודי להערכת דינמיקה מיטוכונדריאלית, ניידות, מורפולוגיה, ביוגנזה ומצב redox. כאן מוצגים ההליכים השונים לתרבות, לרכישת תמונות וניתוח מיטוכונדריאלי עוקב.
אסטרוציטים הם שחקנים קריטיים בתחזוקת הומאוסטזיס במוח. הם אולי ידועים ביותר יש תפקידים מבניים משמעותיים במוח, כחלק ממחסום הדם – מוח1 ועל ידי תמיכה נוירונים וסינפסות ברחבי המוח2. תמיכה אסטרוציטים של נוירונים הוא מבני3 מטבולי4,5, עם אסטרוציטים קידום neurogenesis ו synaptogenesis תוך מתן מטבוליטים מפתח כמו לקטט נוירונים פעילים4,6,7. מעבר לתפקיד התמיכה המבנית, אסטרוציטים הם תאים פעילים שלוקחים חלק ב- Ca2 + איתות ואגירה (כולל זרם מיטוכונדריאלי ספונטני Ca2 + )8,9, K+ אגירה10, ויכולים להתאים ולהגיב לצרכי המוח בזמנים שלפגיעה 11,12 . בהיותם תאים דינמיים כאלה, לאסטרוציטים יש דרישות אנרגיה חזקות, המחייבות רשת מיטוכונדריאלית יעילה. המיטוכונדריה האלה יש גם תפקיד מכריע באגירת מינים חמצן תגובתי מופרז (ROS)13. בנוסף לתפקידים האישיים או המקומיים שלהם של ייצור אנרגיה ואגירת ROS, המיטוכונדריה מתפקדת כרשת14. במובן זה, הם שומרים על שיווי משקל בין ביקוע לבין מיטוכונדריה היתוך, המייצג מיטוכונדריה חדשה / מופחתת ומיטוכונדריה ישנה / מחומצנת, בהתאמה15. ניתן לאמוד את מצב ההוקסם מחדש הכולל של תא על-ידי מצב ההוקסם מחדש של רשת המיטוכונדריה. בפתולוגיה, זוהי פיסת מידע קריטית שיכולה לשפוך אור על אילו תאים לא מתפקדים בצורה אופטימלית.
בשנים האחרונות פותחו חיישנים רבים כדי לחקור את הדינמיקה והפונקציות של המיטוכונדריה בתאים. לדוגמה, חיישנים המודדים חילופי אנרגיה (ATP), מצב redox (NADH/NAD+, ROS) ופונקציונליות אנזימטית (cAMP, Ca2+, Zn2+) משמשים כעת במחקר של פונקציה מיטוכונדריאלית16. ביניהם, MitoTimer מאפשר לעקוב אחר השינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית (גודל, צורה, שטח פנים), ניידות (מהירות, תזוזה) ודינמיקה (אירועי היתוך וביקוע), כמו גם את שיעור המחזור המיטוכונדריאלי הכולל ומצב ההוקסם מחדש. MitoTimer הוא חלבון פלואורסצנטי אדום מוטנטי, drFP58317, עם אות מיטוכונדריאלי מתת-unit VIII של ציטוכרום c אוקסידאז אנושי18,19 כדי לדמיין מיטוכונדריה מסונתזת חדשה בירוק (488 ננומטר) ומיטוכונדריה מחומצנת באדום (555 ננומטר). שימוש ביחס הפלואורסצנטיות הירוק (488 ננומטר) והאדום (555 ננומטר) מאפשר הערכה סימולטנית של המיטוכונדריה הבודדת, ניתוח המורפולוגיה שלהם, אירועי היתוך/ביקוע והיסטוריית מצב20,21. מאפיין ייחודי זה יכול לשמש כדי לחקור שאלות מדעיות רבות לגבי התפקידים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של המיטוכונדריה ולכן הוא מבטיח מאוד לחשיפת המנגנונים הבסיסיים של דינמיקה מיטוכונדריאלית בתוך סוגי תאים רבים ושונים.
לאחרונה פיתחנו וקטור lentiviral חדש (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, להלן נקרא LV-G1-MitoTimer) כדי לחקור את הדינמיקה והפונקציות של המיטוכונדריה במיוחד אסטרוציטים במבחנה וב- vivo22. LV-G1-MitoTimer משתמש בגרסה חתוכה של מקדם החלבון החומצי הפריאלי (GFAP) gfaABC1D, עם משפר B3 (gfaABC1D(B3), להלן G1) בשילוב עם מערכת detargeting עצבית miR124T שתוארה בעבר23. זה מאפשר ביטוי בלעדי של הביונסור המיטוכונדריאלי באסטרוציטים במבחנה וב- vivo22. המוצגים כאן הם השלבים השונים כדי לבצע תרבות של אסטרוציטים היפוקמפוס חולדה ולצייד אותם עם biosensor LV-G1-MitoTimer, כמו גם את השלבים מיקרוסקופיים שונים כדי לעקוב אחר ההתנהגות של מיטוכונדריה אסטרוציטים במהלך מספר שעות / ימים רצופים.
כאן מוצעת שיטה חדשנית לעקוב לאורך הדינמיקה והמחזור של המערכת המיטוכונדריאלית באסטרוציטים תרבותיים. שלא כמו גישה של זמן לשגות על קבוצה קבועה של תאים או תא בודד אחד בכל פעם (בשימוש הנפוץ ביותר בספרות)24,25, חוקרים יכולים לעקוב אחר האבולוציה של המערכת המיטוכונדריאלית במהלך מספר ימים על אותם תאים בודדים. בניגוד להדמיה חיה אחת שבה נדרשות רמות גבוהות של חשיפה לאור, ובחירת תאים בודדים רבים היא פחות ריאלית, השיטה המוצעת מנצלת את יכולתו של מיקרוסקופ זה לדמיין מספר תאים שונים באזורים שונים של באר ולחזור לאותם תאים בנקודות זמן שונות כדי לדמיין אותם מחדש. הודות לנורמליזציה לקו בסיס המתבצע עבור כל קריטריון מדוד בכל תא מעניין, הוא לוקח בחשבון את המורכבות של המערכת המיטוכונדריאלית ובוחן את השפעת הטיפול על כל תא ביחס לתמונת הבסיס שלו. היכולת של המיקרוסקופ לבצע באופן אוטונומי סוג זה של הדמיה על עד 16 בארות בכל פעם (הדמיה 5 תאים לבאר) מאפשרת את ההטרוגניות של המערכת המיטוכונדריאלית להילקח בחשבון כראוי במהלך ניתוח ללא השונות הניסיונית שמגיעה עם הדמיה תנאים שונים בימים שונים.
איכות התרבויות, רמות הזיהומים הנגיפיים המבטאים את הביונסור LV-G1-MitoTimer, סוג המיקרוסקופ והיעדים, ובחירת התאים המתאימים הם משתנים קריטיים שחייבים להישאר עקביים ככל האפשר בפרוטוקול זה. ניתן להתאים את צפיפות התאים, סוג הווקטור והפטירים הנגיפיים בהתאם לשאלה. למרות עבודה קודמת מראה כי ביטוי LV-G1-MitoTimer אין השלכות מזיקות על תפקוד מיטוכונדריאלי ודינמיקה21,22,26,27, זה חיוני כדי לוודא כי הריכוז אינו רעיל עבור התאים (לדוגמה, בדיקת המספר הכולל של תאים בשליטה היטב). כמו מישור מוקד יחיד משמש, אסטרוציטים צריך להיות: (1) שטוח ככל האפשר, (2) מבודד מתאים מסומנים אחרים (כדי לפשט את הניתוח במקרה של עקירה בצלחת), ו (3) בעל רמות פלואורסצנטיות גבוהות. כמו תאים בתרבית יכול להיות משתנה מאוד במורפולוגיה, המערכת המיטוכונדריאלית יכולה להיות הטרוגנית מאוד. בהקשר זה, ניתוח ROIs (ולא התא כולו) מפצה על אזורים בעייתיים מסוימים, כגון אזורי perinuclear, ומקטין את השונות. זה חיוני לעשות את הבסיס על תאים דומים יחסית ולדגום תאים רבים ככל האפשר. כתוצאה מכך, מיקרוסקופים של רכישת תוכן וניתוח תוכן גבוהים מתאימים באופן אידיאלי. במהלך ניטור אורך זה, חשוב גם לא חשיפת יתר של התאים לאור כדי למנוע הלבנה biosensor.
שיטת הדמיה זו אינה נטולת המורכבות שלה, ולאורך הפרוטוקול נכללות מספר הערות, אשר לוקחות בחשבון פתרון בעיות שנעשה במהלך בדיקות קודמות עם המיקרוסקופ. לדוגמה, הבחירה של ציפוי צלחת בשימוש תלויה במבחן המיועד, אבל המלצות עבור האפשרויות המתאימות ביותר עבור תרבויות ראשוניות אסטרוציטים נכללו. בנוסף, רכישת תמונה צריכה להתבצע על לפחות 5 תאים לכל תנאי עקב שונות בין-תאית. ליתר דיוק, כמה תאים שנבחרו בהדמיה בסיסית ימותו, חלקם יצאו מהמסגרת של אזור רכישת התמונות שהוקצה, וחלקם ישנו את המורפולוגיה שלהם, מה שהופך את המיטוכונדריה לקשה מאוד לאינדיבידואליזציה בניתוח. הדמיה של תאים רבים מההתחלה מגדילה את הסבירות של גודל מדגם גדול מספיק של תאים לנתח בסוף הניסוי. בנוסף להיבטים המורכבים יותר של טכניקת הדמיה זו, ישנן כמה מגבלות על הסף ככל מי יכול להפיק תועלת מסוג זה של הדמיה וניתוח. על מנת לנצל את מלוא היתרונות של אוטומציה של רכישת תמונה, המיקרוסקופ המשמש חייב להיות בעל מערכת פוקוס אוטומטי שיכולה להתמודד עם מהירות מרווחי הזמן בין תמונות (כלומר, כל 3 שניות בפרוטוקול זה) ויכולה להתמקד בעקביות בתא המדובר לפני כל תמונה נלקחת. בנוסף, ללא תוכנת JOBS, אשר הופכת את כל תהליך רכישת התמונה לאוטומטי, שיטה זו הופכת מפרכת ופוטנציאל בלתי אפשרי בהתאם למספר התאים שמצולם מכיוון שהיא תדרוש חיפוש והדמיה ידנית של כל תא שוב בנקודת הזמן המתאימה. לבסוף, שיטת הדמיה זו אינה חסינה לסוגיית ההלבנה. מסיבה זו, כמו בכל שיטת רכישה ארוכת טווח, חשוב לבחור סמנים פלואורסצנטיים שפחות רגישים להלבנה בתמונה ולהתאים את רכישת התמונות כדי למנוע בעיה זו ככל האפשר.
טכניקה זו שונה מאחרים המשמשים כיום באופן מכריע. שלא כמו מחקרים אחרים של זמן לשגות, טכניקה זו אינה דורשת הדמיה על אותה תנוחה בבאר כל הזמן, וגם אינה דורשת תנועה ידנית של הצלחת כדי לדמיין אזורים אחרים. זה מאפשר לחוקרים את היכולת לדמיין תאים רבים בתנאים רבים במסגרת זמן אחת של 24 שעות. כתוצאה מכך, היכולת לבצע הדמיה וניתוח זה על תאים רבים בכל באר נותנת לאותו מידע אוכלוסיה שניתן היה להשיג ממחקר רחב של קבוצה גדולה של תאים תוך מתן אמצעים ספציפיים מכל תא שמצולם. בעוד כמה ספציפיים לשיטה זו לא יכול לחול על שיטות רכישת תמונה אחרות (מתואר לעיל), היתרונות עולים על הסיבוכים עם סוג הניתוח האפשרי לאחר הרכישה. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לראות את ההשלכות המדויקות של טיפולים שונים על המערכת המיטוכונדריאלית, וכתוצאה מכך, על אסטרוציטים מתורבתים.
בנוסף, שיטה זו ניתנת להתאמה אישית רבה לשאלות מדעיות רבות ושונות לגבי התנהגות מיטוכונדריאלית ותפקידים בהקשרים ספציפיים. כאן הפרוטוקול המתואר עוסק במיוחד עם אסטרוציטים מתורבתים. עם זאת, סוגים רבים אחרים של תאים יכולים לשמש, ואת הטיפולים שניתן לבדוק מוגבלים רק על ידי השאלות הנחקרות. סוג זה של הדמיה יש פוטנציאל לקדם את הידע הקולקטיבי והבנה של התנהגות מיטוכונדריאלית, המנגנונים הבסיסיים המובילים לתפקוד מיטוכונדריאלי, ואת ההשפעות של פתולוגיות רבות על הדינמיקה המולדת הקיימת בסוגים שונים של תאים.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי מלגת קרן סינפסיס שהוענקה לקיי.אר ול בית החולים האוניברסיטאי לוזאן (CHUV). המחברים מודים לנייקון על עזרתם, ובמיוחד לג’יי גנווט.
µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 – C13440-20CU | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |