本文介绍了配备MitoTimer生物传感器的星形胶质细胞培养物的线粒体延时成像方法,以及由此产生的线粒体动力学,迁移率,形态,生物发生,氧化还原状态和周转的多参数分析。
虽然在神经元水平上对线粒体改变给予了很大的关注,但最近的证据表明,星形胶质细胞中的线粒体动力学和功能与认知有关。本文介绍了配备线粒体生物传感器的星形胶质细胞培养物的延时成像方法:MitoTimer。MitoTimer是一种强大而独特的工具,用于评估线粒体动力学,移动性,形态学,生物发生和氧化还原状态。在这里,介绍了培养,图像采集和随后的线粒体分析的不同程序。
星形胶质细胞是维持大脑稳态的关键参与者。它们可能最广为人知的是作为血脑屏障1的一部分以及通过支持整个大脑的神经元和突触2在大脑中具有显着的结构作用。星形胶质细胞对神经元的支持是结构3和代谢4、5,星形胶质细胞促进神经发生和突触发生,同时也为活跃神经元4、6、7提供乳酸等关键代谢物。除了结构支持的作用外,星形胶质细胞是参与Ca2 +信号传导和缓冲(包括自发线粒体Ca2 +流入)8,9,K+缓冲10的活性细胞,并且可以在受伤时适应和反应大脑的需求11,12.作为这样的动态细胞,星形胶质细胞具有强大的能量需求,这需要一个有效的线粒体网络。这些线粒体在缓冲过量活性氧(ROS)13方面也起着至关重要的作用。除了它们的能量产生和ROS缓冲的个体或局部作用外,线粒体还充当网络14。从这个意义上说,它们保持裂变和融合线粒体之间的平衡,分别代表新的/减少的线粒体和旧的/氧化的线粒体15。细胞的整体氧化还原状态可以通过线粒体网络的氧化还原状态来衡量。在病理学中,这是一条关键信息,可以揭示哪些细胞可能功能不佳。
近年来,已经开发了许多传感器来研究细胞中线粒体的动力学和功能。例如,测量能量交换(ATP),氧化还原状态(NADH / NAD+,ROS)和酶功能(cAMP,Ca2+,Zn2 +)的传感器目前用于线粒体功能16的研究。其中,MitoTimer允许跟踪线粒体形态(大小,形状,表面积),移动性(速度,位移)和动力学(融合和裂变事件)的变化,以及整体线粒体周转率和氧化还原状态。MitoTimer是一种突变的红色荧光蛋白drFP58317,具有来自人细胞色素c氧化酶18,19的亚基VIII的线粒体信号,用于可视化新合成的绿色线粒体(488nm)和红色(555nm)的氧化线粒体。使用绿色(488 nm)和红色(555 nm)荧光比可以同时评估单个线粒体,其形态分析,融合/裂变事件和氧化还原状态历史20,21。这种独特的性质可用于研究有关线粒体生理和病理作用的许多科学问题,因此对于揭示许多不同细胞类型中线粒体动力学的潜在机制非常有希望。
我们最近开发了一种新的慢病毒载体(LV-G1-MitoTimer-MiR124T,以下简称LV-G1-MitoTimer)来研究线粒体的动态和功能,特别是在体外和体内的星形胶质细胞22中。LV-G1-MitoTimer使用神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子gfaABC1D的截断版本,具有B3增强子(gfaABC1D(B3),以下称为G1)与先前描述的miR124T神经元去靶向系统23相结合。它允许线粒体生物传感器在体外和体内22中的星形胶质细胞中排他性表达。这里介绍的是进行大鼠海马星形胶质细胞培养并为其配备LV-G1-MitoTimer生物传感器的不同步骤,以及跟踪星形胶质细胞线粒体在连续几小时/几天内的行为的不同显微镜步骤。
在这里,提出了一种纵向跟踪培养的星形胶质细胞中线粒体系统的动力学和周转的新方法。与对一组固定的细胞或一次一个细胞(文献中最常用的)进行延时方法不同24,25,研究人员可以在几天内跟踪线粒体系统在同一单个细胞上的进化。与需要高水平光照的单孔实时成像相比,并且选择许多单个细胞不太可行,所提出的方法利用该显微镜在孔的不同区域对多个不同细胞进行成像的能力,并在不同的时间点返回这些相同的细胞以重新成像它们。由于对每个目标细胞的每个测量标准进行的基线归一化,它考虑了线粒体系统的复杂性,并研究了治疗相对于其自身基线图像对每个细胞的影响。显微镜能够一次在多达16个孔上自主进行这种类型的成像(每孔成像5个细胞),允许在分析过程中正确考虑线粒体系统的异质性,而不会产生不同日期成像各种条件所带来的实验变异性。
培养物的质量,表达LV-G1-MitoTimer生物传感器的病毒感染水平,显微镜和物镜的类型以及合适细胞的选择是关键变量,必须在此方案中尽可能保持一致。细胞密度,载体类型和病毒滴度可以根据问题进行调整。虽然先前的研究表明LV-G1-MitoTimer表达对线粒体功能和动力学21,22,26,27没有有害后果,但必须验证浓度对细胞无毒(例如,检查控制良好的细胞总数)。由于使用单个焦平面,星形胶质细胞应:(1)尽可能平坦,(2)与其他标记细胞分离(以简化培养皿中位移情况下的分析),以及(3)具有高荧光水平。由于培养物中的细胞在形态上可能高度可变,因此线粒体系统可以是高度异质的。在这种情况下,分析ROI(而不是整个细胞)可以补偿一些有问题的区域,例如核周区域,并降低变异性。在相对相似的细胞上进行基线测试并尽可能多地对细胞进行采样至关重要。因此,高内涵采集和分析显微镜是理想的选择。在这种纵向监测期间,同样重要的是不要将细胞过度暴露在光线下,以避免生物传感器漂白。
这种成像方法并非没有复杂性,并且在整个实验方案中,包括几个注释,这些注释考虑了在以前使用显微镜进行测试期间进行的故障排除。例如,所用板包衣的选择取决于预期的测定方法,但已经包括了星形胶质细胞原代培养物最合适选择的建议。此外,由于细胞间变异性,每种条件应至少对5个细胞进行图像采集。更具体地说,在基线成像中选择的一些细胞会死亡,一些会移出指定图像采集区域的框架,还有一些会改变它们的形态,使得线粒体在分析中很难个体化。从一开始就对许多细胞进行成像,增加了在实验结束时分析足够大的细胞样本量的可能性。除了这种成像技术更复杂的方面之外,就谁可以从这种类型的成像和分析中受益而言,还存在一些明显的局限性。为了充分利用图像采集的自动化,所使用的显微镜必须具有自动对焦系统,该系统可以处理图像之间的时间间隔速度(即,本方案中的每3秒),并且可以在拍摄每张图像之前始终如一地聚焦在所讨论的细胞上。此外,如果没有使整个图像采集过程自动化的JOBS软件,这种方法变得艰巨且可能是不可能的,具体取决于要成像的细胞数量,因为它需要在适当的时间点再次手动查找和成像每个细胞。最后,这种成像方法也不能幸免于光漂白的问题。因此,与任何长期采集方法一样,重要的是选择不易受到光漂白影响的荧光标记物,并定制图像采集以尽可能避免此问题。
这种技术与目前以关键方式使用的其他技术不同。与其他延时研究不同,该技术不需要在整个过程中在孔中的相同位置进行成像,也不需要手动移动板以对其他区域进行成像。这使得研究人员能够在一个24小时的时间内对许多条件下的许多细胞进行成像。因此,对每个孔中的许多细胞进行这种成像和分析的能力提供了相同的群体信息,这些信息可以从广泛研究一大组细胞中获得,同时另外提供来自每个成像细胞的特定测量值。虽然这种方法的某些特性可能不适用于其他图像采集方法(如上所述),但其好处超过了采集后分析类型的复杂性。这项技术使研究人员能够看到各种治疗对线粒体系统的确切影响,从而对培养的星形胶质细胞的影响。
此外,该方法可高度定制,以适应有关特定环境中线粒体行为和角色的许多不同科学问题。这里概述的方案专门处理培养的星形胶质细胞。然而,可以使用许多其他细胞类型,并且可以测试的治疗方法仅受所研究问题的限制。这种类型的成像有可能促进对线粒体行为的集体知识和理解,导致线粒体功能障碍的潜在机制,以及许多病理学对不同类型细胞中存在的先天动力学的影响。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了Synapsis基金会奖学金的支持,该奖学金授予K.R.和洛桑大学医院(CHUV)。作者感谢尼康的帮助,特别是J. Gannevat。
µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 – C13440-20CU | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |