Cet article décrit la méthode d’imagerie en accéléré mitochondrial des cultures d’astrocytes équipées du biocapteur MitoTimer et l’analyse multiparamétrique résultante de la dynamique mitochondriale, de la mobilité, de la morphologie, de la biogenèse, de l’état redox et du renouvellement.
Bien qu’une grande attention ait été accordée aux altérations mitochondriales au niveau neuronal, des preuves récentes démontrent que la dynamique et la fonction mitochondriales dans les astrocytes sont impliquées dans la cognition. Cet article décrit la méthode d’imagerie time-lapse de cultures d’astrocytes équipées d’un biocapteur mitochondrial : MitoTimer. MitoTimer est un outil puissant et unique pour évaluer la dynamique mitochondriale, la mobilité, la morphologie, la biogenèse et l’état redox. Ici, les différentes procédures de culture, d’acquisition d’images et d’analyse mitochondriale ultérieure sont présentées.
Les astrocytes sont des acteurs essentiels dans le maintien de l’homéostasie cérébrale. Ils sont peut-être les plus connus pour avoir des rôles structurels importants dans le cerveau, dans le cadre de la barrière hémato-encéphalique1 et en soutenant les neurones et les synapses dans tout le cerveau2. Le soutien astrocytaire des neurones est à la fois structurel3 et métabolique4,5,les astrocytes favorisant la neurogenèse et la synaptogenèse tout en fournissant des métabolites clés comme le lactate aux neurones actifs4,6,7. Au-delà du rôle de soutien structurel, les astrocytes sont des cellules actives qui participent à la signalisation et à la mise en mémoire tampon du Ca2+ (y compris les afflux spontanés mitochondriaux de Ca2+) 8,9,K+ tampon10, et peuvent s’adapter et réagir aux besoins du cerveau en période de blessure11,12 . Étant de telles cellules dynamiques, les astrocytes ont des besoins énergétiques robustes, ce qui nécessite un réseau mitochondrial efficace. Ces mitochondries ont également un rôle crucial dans la mise en mémoire tampon des espèces réactives excessives de l’oxygène (ROS)13. En plus de leurs rôles individuels ou locaux de production d’énergie et de tampon ROS, les mitochondries fonctionnent comme un réseau14. En ce sens, ils maintiennent l’équilibre entre les mitochondries fissionnelles et fusionnelles, représentant respectivement les mitochondries nouvelles/réduites et les mitochondries plus anciennes/oxydées15. L’état redox global d’une cellule peut être mesuré par l’état redox du réseau mitochondrial. En pathologie, il s’agit d’une information essentielle qui peut faire la lumière sur les cellules qui peuvent ne pas fonctionner de manière optimale.
Ces dernières années, de nombreux capteurs ont été développés pour étudier la dynamique et les fonctions des mitochondries dans les cellules. Par exemple, des capteurs mesurant l’échange d’énergie (ATP), l’état redox (NADH/NAD+,ROS) et la fonctionnalité enzymatique (cAMP, Ca2+,Zn2+)sont actuellement utilisés dans l’étude de la fonction mitochondriale16. Parmi eux, MitoTimer permet de suivre les changements de morphologie mitochondriale (taille, forme, surface), de mobilité (vitesse, déplacement) et de dynamique (événements de fusion et de fission), ainsi que le taux de renouvellement mitochondrial global et l’état redox. MitoTimer est une protéine fluorescente rouge mutante, drFP58317, avec un signal mitochondrial de la sous-unité VIII de la cytochrome c oxydasehumaine 18,19 pour visualiser les mitochondries nouvellement synthétisées en vert (488 nm) et les mitochondries oxydées en rouge (555 nm). L’utilisation du rapport de fluorescence vert (488 nm) et rouge (555 nm) permet d’évaluer simultanément les mitochondries individuelles, leur analyse morphologique, les événements de fusion / fission et l’historique de l’état redox20,21. Cette propriété unique peut être utilisée pour étudier de nombreuses questions scientifiques concernant les rôles physiologiques et pathologiques des mitochondries et est donc très prometteuse pour dévoiler les mécanismes sous-jacents de la dynamique mitochondriale dans de nombreux types de cellules différents.
Nous avons récemment développé un nouveau vecteur lentiviral (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, ci-après appelé LV-G1-MitoTimer) pour étudier la dynamique et les fonctions des mitochondries spécifiquement dans les astrocytes in vitro et in vivo22. LV-G1-MitoTimer utilise une version tronquée du promoteur de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) gfaABC1D, avec un amplificateur B3 (gfaABC1D(B3), ci-après appelé G1) combiné avec le système de détargeting neuronal miR124T précédemment décrit23. Il permet l’expression exclusive du biocapteur mitochondrial dans les astrocytes in vitro et in vivo22. Voici les différentes étapes pour effectuer une culture d’astrocytes hippocampiques de rat et les équiper du biocapteur LV-G1-MitoTimer, ainsi que les différentes étapes de microscopie pour suivre le comportement des mitochondries astrocytaires pendant plusieurs heures/jours consécutifs.
Ici, une nouvelle méthode pour suivre longitudinalement la dynamique et le renouvellement du système mitochondrial dans un astrocyte cultivé est proposée. Contrairement à une approche time-lapse sur un groupe fixe de cellules ou une cellule individuelle à la fois (le plus souvent utilisée dans la littérature)24,25,les chercheurs peuvent suivre l’évolution du système mitochondrial pendant plusieurs jours sur les mêmes cellules individuelles. Contrairement à l’imagerie en direct à puits unique où des niveaux élevés d’exposition à la lumière sont requis et où la sélection de nombreuses cellules individuelles est moins réalisable, la méthode proposée tire parti de la capacité de ce microscope à imager plusieurs cellules différentes dans différentes zones d’un puits et à revenir à ces mêmes cellules à différents moments pour les réimager. Grâce à la normalisation à une ligne de base réalisée pour chaque critère mesuré sur chaque cellule d’intérêt, il prend en compte la complexité du système mitochondrial et étudie l’effet du traitement sur chaque cellule par rapport à sa propre image de base. La capacité du microscope à effectuer de manière autonome ce type d’imagerie sur jusqu’à 16 puits à la fois (imagerie de 5 cellules par puits) permet de prendre en compte correctement l’hétérogénéité du système mitochondrial lors de l’analyse sans la variabilité expérimentale qui accompagne l’imagerie de diverses conditions à différents jours.
La qualité des cultures, les niveaux d’infections virales exprimant le biocapteur LV-G1-MitoTimer, le type de microscope et d’objectifs, ainsi que la sélection de cellules appropriées sont des variables critiques qui doivent rester aussi cohérentes que possible dans ce protocole. Les densités cellulaires, le type de vecteur et les titres viraux peuvent être adaptés en fonction de la question. Bien que des travaux antérieurs montrent que l’expression de LV-G1-MitoTimer n’a pas de conséquences délétères sur la fonction mitochondriale et la dynamique21,22, 26,27, il est essentiel de vérifier que la concentration n’est pas toxique pour les cellules (par exemple, en vérifiant bien le nombre total de cellules en contrôle). Comme un seul plan focal est utilisé, les astrocytes doivent être: (1) aussi plats que possible, (2) isolés d’autres cellules marquées (pour simplifier l’analyse en cas de déplacement dans la boîte), et (3) possédant des niveaux de fluorescence élevés. Comme les cellules en culture peuvent être très variables en morphologie, le système mitochondrial peut être très hétérogène. Dans ce contexte, l’analyse des ROI (et non de la cellule entière) compense certaines régions problématiques, telles que les régions périnucléaires, et diminue la variabilité. Il est essentiel de faire la ligne de base sur des cellules relativement similaires et d’échantillonner autant de cellules que possible. Par conséquent, les microscopes d’acquisition et d’analyse à haut contenu sont parfaitement adaptés. Au cours de cette surveillance longitudinale, il est également important de ne pas surexposer les cellules à la lumière pour éviter le blanchiment des biocapteurs.
Cette méthode d’imagerie n’est pas sans complexités, et tout au long du protocole, plusieurs notes sont incluses, qui prennent en compte le dépannage effectué lors de tests précédents avec le microscope. Par exemple, le choix du revêtement de plaque utilisé dépend du dosage prévu, mais des recommandations pour les choix les plus appropriés pour les cultures primaires d’astrocytes ont été incluses. De plus, l’acquisition d’images doit être effectuée sur au moins 5 cellules par condition en raison de la variabilité intercellulaire. Plus précisément, certaines cellules sélectionnées lors de l’imagerie de base mourront, certaines sortiront du cadre de la zone d’acquisition d’image assignée et d’autres modifieront leur morphologie, ce qui rendra les mitochondries très difficiles à individualiser dans l’analyse. L’imagerie de nombreuses cellules dès le début augmente la probabilité d’un échantillon suffisamment grand de cellules à analyser à la fin de l’expérience. En plus des aspects plus complexes de cette technique d’imagerie, il existe des limites absolues quant à savoir qui peut bénéficier de ce type d’imagerie et d’analyse. Afin de tirer pleinement parti de l’automatisation de l’acquisition d’images, le microscope utilisé doit disposer d’un système de mise au point automatique capable de gérer la vitesse des intervalles de temps entre les images (c’est-à-dire toutes les 3 s dans ce protocole) et de se concentrer systématiquement sur la cellule en question avant que chaque image ne soit prise. De plus, sans le logiciel JOBS, qui automatise l’ensemble du processus d’acquisition d’images, cette méthode devient ardue et potentiellement impossible en fonction du nombre de cellules imagées, car elle nécessiterait de trouver et d’imager manuellement chaque cellule à nouveau au moment approprié. Enfin, cette méthode d’imagerie n’est pas à l’abri de la question du photoblanchiment. Pour cette raison, comme pour toute méthode d’acquisition à long terme, il est important de choisir des marqueurs fluorescents moins sensibles au photoblanchiment et d’adapter l’acquisition d’images pour éviter ce problème autant que possible.
Cette technique diffère des autres actuellement utilisées de manière cruciale. Contrairement à d’autres études en accéléré, cette technique ne nécessite pas d’imagerie sur la même position dans le puits pendant tout le temps, ni un mouvement manuel de la plaque pour imager d’autres zones. Cela permet aux chercheurs d’imager de nombreuses cellules dans de nombreuses conditions en une seule période de 24 heures. Par conséquent, la capacité d’effectuer cette imagerie et cette analyse sur de nombreuses cellules dans chaque puits donne les mêmes informations de population que l’on obtiendrait en étudiant largement un grand groupe de cellules tout en fournissant des mesures spécifiques de chaque cellule imagée. Bien que certaines spécificités de cette méthode puissent ne pas s’appliquer à d’autres méthodes d’acquisition d’images (décrites ci-dessus), les avantages l’emportent sur les complications liées au type d’analyse possible après l’acquisition. Cette technique permet aux chercheurs de voir les ramifications exactes de divers traitements sur le système mitochondrial et, par conséquent, sur les astrocytes cultivés.
En outre, cette méthode est hautement personnalisable à de nombreuses questions scientifiques différentes concernant le comportement et les rôles mitochondriaux dans des contextes spécifiques. Ici, le protocole décrit traite spécifiquement des astrocytes cultivés. Cependant, de nombreux autres types de cellules peuvent être utilisés, et les traitements qui peuvent être testés ne sont limités que par les questions étudiées. Ce type d’imagerie a le potentiel de faire progresser la connaissance et la compréhension collectives du comportement mitochondrial, des mécanismes sous-jacents qui conduisent au dysfonctionnement mitochondrial et des effets de nombreuses pathologies sur la dynamique innée présente dans différents types de cellules.
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été soutenue par une bourse de la Fondation Synapsis attribuée à K.R. et au CHUV . Les auteurs remercient Nikon pour leur aide, en particulier J. Gannevat.
µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 – C13440-20CU | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |