Dieser Artikel beschreibt die Methode zur mitochondrialen Zeitraffer-Bildgebung von Astrozytenkulturen, die mit dem MitoTimer-Biosensor ausgestattet sind, und die daraus resultierende multiparametrische Analyse der mitochondrialen Dynamik, Mobilität, Morphologie, Biogenese, Redoxzustand und Umsatz.
Während den mitochondrialen Veränderungen auf neuronaler Ebene viel Aufmerksamkeit geschenkt wurde, zeigen neuere Beweise, dass mitochondriale Dynamik und Funktion in Astrozyten an der Kognition beteiligt sind. Dieser Artikel beschreibt die Methode zur Zeitraffer-Bildgebung von Astrozytenkulturen, die mit einem mitochondrialen Biosensor ausgestattet sind: MitoTimer. MitoTimer ist ein leistungsstarkes und einzigartiges Werkzeug zur Beurteilung der mitochondrialen Dynamik, Mobilität, Morphologie, Biogenese und des Redoxzustands. Hier werden die verschiedenen Verfahren zur Kultur, Bildaufnahme und anschließenden mitochondrialen Analyse vorgestellt.
Astrozyten sind entscheidende Akteure bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns. Es ist vielleicht am bekanntesten, dass sie eine bedeutende strukturelle Rolle im Gehirn spielen, als Teil der Blut-Hirn-Schranke1 und durch die Unterstützung von Neuronen und Synapsen im gesamten Gehirn2. Die Astrozytenunterstützung von Neuronen ist sowohl strukturell3 als auchmetabolisch 4,5, wobei Astrozyten die Neurogenese und Synaptogenese fördern und gleichzeitig Schlüsselmetaboliten wie Laktat an aktive Neuronenliefern 4,6,7. Über die Rolle der strukturellen Unterstützung hinaus sind Astrozyten aktive Zellen, die an der Ca2+-Signalisierung und -Pufferung (einschließlich spontaner mitochondrialer Ca2+-Zuflüsse) 8,9, K+ Pufferung10beteiligt sind und sich in Zeiten der Verletzung an die Bedürfnisse des Gehirns anpassen und reagieren können11,12 . Als solche dynamischen Zellen haben Astrozyten einen robusten Energiebedarf, der ein effizientes mitochondriales Netzwerk erfordert. Diese Mitochondrien spielen auch eine entscheidende Rolle bei der Pufferung übermäßig reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)13. Zusätzlich zu ihrer individuellen oder lokalen Rolle der Energieerzeugung und ROS-Pufferung fungieren Mitochondrien als Netzwerk14. In diesem Sinne halten sie das Gleichgewicht zwischen spaltenden und fusionierenden Mitochondrien aufrecht, die neue/reduzierte Mitochondrien bzw. ältere/oxidierte Mitochondrien darstellen15. Der gesamte Redoxzustand einer Zelle kann durch den Redoxzustand des mitochondrialen Netzwerks gemessen werden. In der Pathologie ist dies eine kritische Information, die Aufschluss darüber geben kann, welche Zellen möglicherweise nicht optimal funktionieren.
In den letzten Jahren wurden viele Sensoren entwickelt, um die Dynamik und Funktionen von Mitochondrien in Zellen zu untersuchen. Zum Beispiel werden Sensoren, die den Energieaustausch (ATP), den Redoxzustand (NADH / NAD+, ROS) und die enzymatische Funktionalität (cAMP, Ca2 +, Zn2 +) messen, derzeit bei der Untersuchung der mitochondrialen Funktionverwendet 16. Unter ihnen ermöglicht MitoTimer, die Veränderungen der mitochondrialen Morphologie (Größe, Form, Oberfläche), Mobilität (Geschwindigkeit, Verschiebung) und Dynamik (Fusions- und Spaltereignisse) sowie der gesamten mitochondrialen Fluktuationsrate und des Redoxzustands zu verfolgen. MitoTimer ist ein mutiertes rot fluoreszierendes Protein, drFP58317, mit einem mitochondrialen Signal von der Untereinheit VIII der menschlichen Cytochrom-c-Oxidase18,19 zur Visualisierung neu synthetisierter Mitochondrien in grün (488 nm) und oxidierter Mitochondrien in rot (555 nm). Die Verwendung des grünen (488 nm) und roten (555 nm) Fluoreszenzverhältnisses ermöglicht die gleichzeitige Auswertung einzelner Mitochondrien, ihrer Morphologieanalyse, fusions- / spaltereignisse und der Redoxzustandsgeschichte20,21. Diese einzigartige Eigenschaft kann genutzt werden, um viele wissenschaftliche Fragen zur physiologischen und pathologischen Rolle der Mitochondrien zu untersuchen, und ist daher sehr vielversprechend, um die zugrunde liegenden Mechanismen der mitochondrialen Dynamik in vielen verschiedenen Zelltypen aufzudecken.
Wir haben kürzlich einen neuen lentiviralen Vektor (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, im Folgenden LV-G1-MitoTimer genannt) entwickelt, um die Dynamik und Funktionen der Mitochondrien speziell in Astrozyten in vitro und in vivozu untersuchen22. LV-G1-MitoTimer verwendet eine gekürzte Version des Glialfibrillary Acidic Protein (GFAP) Promotors gfaABC1D, mit einem B3 Enhancer (gfaABC1D(B3), im Folgenden G1 genannt) kombiniert mit dem zuvor beschriebenen miR124T neuronalen Detargeting-System23. Es ermöglicht die exklusive Expression des mitochondrialen Biosensors in Astrozyten in vitro und in vivo22. Hier werden die verschiedenen Schritte vorgestellt, um eine Kultur von Ratten-Hippocampus-Astrozyten durchzuführen und sie mit dem LV-G1-MitoTimer-Biosensor auszustatten, sowie die verschiedenen Mikroskopieschritte, um das Verhalten von Astrozyten-Mitochondrien während mehrerer aufeinanderfolgender Stunden / Tage zu verfolgen.
Hier wird eine neuartige Methode vorgeschlagen, um die Dynamik und den Umsatz des mitochondrialen Systems in einem kultivierten Astrozyten longitudinal zu verfolgen. Im Gegensatz zu einem Zeitrafferansatz an einer festen Gruppe von Zellen oder einer einzelnen Zelle gleichzeitig (am häufigsten in der Literatur verwendet)24,25, können Forscher die Entwicklung des mitochondrialen Systems während mehrerer Tage auf denselben einzelnen Zellen verfolgen. Im Gegensatz zur Single-Well-Live-Bildgebung, bei der eine hohe Lichtexposition erforderlich ist und die Auswahl vieler einzelner Zellen weniger möglich ist, nutzt die vorgeschlagene Methode die Fähigkeit dieses Mikroskops, mehrere verschiedene Zellen in verschiedenen Bereichen eines Brunnens abzubilden und zu verschiedenen Zeitpunkten zu denselben Zellen zurückzukehren, um sie neu abzubilden. Dank der Normalisierung auf eine Baseline, die für jedes gemessene Kriterium an jeder Zelle von Interesse durchgeführt wird, berücksichtigt es die Komplexität des mitochondrialen Systems und untersucht die Wirkung der Behandlung auf jede Zelle relativ zu ihrem eigenen Baseline-Bild. Die Fähigkeit des Mikroskops, diese Art der Bildgebung autonom an bis zu 16 Vertiefungen gleichzeitig durchzuführen (Abbildung von 5 Zellen pro Vertiefung), ermöglicht es, die Heterogenität des mitochondrialen Systems während der Analyse angemessen zu berücksichtigen, ohne die experimentelle Variabilität, die mit der Abbildung verschiedener Bedingungen an verschiedenen Tagen einhergeht.
Die Qualität der Kulturen, die Konzentration der Virusinfektionen, die den LV-G1-MitoTimer-Biosensor exprimieren, die Art des Mikroskops und der Objektive sowie die Auswahl geeigneter Zellen sind kritische Variablen, die in diesem Protokoll so konsistent wie möglich bleiben müssen. Die Zelldichten, die Art des Vektors und die viralen Titer können je nach Fragestellung angepasst werden. Obwohl frühere Arbeiten gezeigt haben, dass die LV-G1-MitoTimer-Expression keine schädlichen Folgen für die mitochondriale Funktion und Dynamikhat 21,22,26,27, ist es wichtig zu überprüfen, ob die Konzentration für die Zellen nicht toxisch ist (z. B. überprüfung der Gesamtzahl der Zellen in der Kontrolle gut). Da eine einzelne Fokusebene verwendet wird, sollten Astrozyten: (1) so flach wie möglich, (2) von anderen markierten Zellen isoliert sein (um die Analyse im Falle einer Verschiebung in der Schale zu vereinfachen) und (3) hohe Fluoreszenzwerte aufweisen. Da Zellen in Kultur in der Morphologie sehr variabel sein können, kann das mitochondriale System sehr heterogen sein. In diesem Zusammenhang kompensiert die Analyse von ROIs (und nicht der gesamten Zelle) einige problematische Regionen, wie die perinukleären Regionen, und verringert die Variabilität. Es ist wichtig, die Baseline auf relativ ähnlichen Zellen durchzuführen und so viele Zellen wie möglich zu beproben. Daher sind High-Content-Erfassungs- und Analysemikroskope ideal geeignet. Bei diesem Längsschnittmonitoring ist es auch wichtig, die Zellen nicht zu sehr lichtbelichtet zu machen, um eine Bleiche des Biosensors zu vermeiden.
Diese Bildgebungsmethode ist nicht ohne Komplexität, und während des gesamten Protokolls sind mehrere Notizen enthalten, die die Fehlerbehebung bei früheren Tests mit dem Mikroskop berücksichtigen. Zum Beispiel hängt die Wahl der verwendeten Plattenbeschichtung vom beabsichtigten Assay ab, aber Empfehlungen für die am besten geeignete Auswahl für Astrozyten-Primärkulturen wurden enthalten. Darüber hinaus sollte die Bildaufnahme aufgrund der interzellulären Variabilität an mindestens 5 Zellen pro Zustand durchgeführt werden. Genauer gesagt, einige Zellen, die bei der Baseline-Bildgebung ausgewählt werden, sterben ab, einige bewegen sich aus dem Rahmen des zugewiesenen Bildaufnahmebereichs und einige ändern ihre Morphologie, was die Individualisierung der Mitochondrien in der Analyse sehr schwierig macht. Die Abbildung vieler Zellen von Anfang an erhöht die Wahrscheinlichkeit einer ausreichend großen Stichprobengröße von Zellen, die am Ende des Experiments analysiert werden können. Zusätzlich zu den komplexeren Aspekten dieser Bildgebungstechnik gibt es einige absolute Einschränkungen, wer von dieser Art der Bildgebung und Analyse profitieren kann. Um die Vorteile der Automatisierung der Bildaufnahme voll ausschöpfen zu können, muss das verwendete Mikroskop über ein Autofokussystem verfügen, das die Geschwindigkeit der Zeitintervalle zwischen den Bildern (d. H. Alle 3 s in diesem Protokoll) bewältigen und sich konsequent auf die betreffende Zelle konzentrieren kann, bevor jedes Bild aufgenommen wird. Darüber hinaus wird diese Methode ohne die JOBS-Software, die den gesamten Bildaufnahmeprozess automatisiert, mühsam und möglicherweise unmöglich, abhängig von der Anzahl der zellen, die abgebildet werden, da es erforderlich wäre, jede Zelle zum richtigen Zeitpunkt manuell zu finden und abzubilden. Schließlich ist diese bildgebende Methode nicht immun gegen das Problem des Photobleichens. Aus diesem Grund ist es, wie bei jeder Langzeiterfassungsmethode, wichtig, fluoreszierende Marker zu wählen, die weniger anfällig für Photobleiching sind, und die Bildaufnahme so anzupassen, dass dieses Problem so weit wie möglich vermieden wird.
Diese Technik unterscheidet sich von anderen, die derzeit verwendet werden, in entscheidender Weise. Im Gegensatz zu anderen Zeitrafferstudien erfordert diese Technik keine Bildgebung an der gleichen Position im Bohrloch die ganze Zeit, noch erfordert sie eine manuelle Bewegung der Platte, um andere Bereiche abzubilden. Dies ermöglicht es den Forschern, viele Zellen unter vielen Bedingungen in einem Zeitrahmen von 24 Stunden abzubilden. Folglich liefert die Fähigkeit, diese Bildgebung und Analyse an vielen Zellen in jedem Bohrloch durchzuführen, die gleichen Populationsinformationen, die man durch die umfassende Untersuchung einer großen Gruppe von Zellen erhalten würde, während zusätzlich spezifische Messungen von jeder abgebildeten Zelle bereitgestellt werden. Während einige Besonderheiten dieser Methode möglicherweise nicht für andere Bildaufnahmemethoden gelten (siehe oben), überwiegen die Vorteile die Komplikationen bei der Art der Analyse, die nach der Aufnahme möglich ist. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, die genauen Auswirkungen verschiedener Behandlungen auf das mitochondriale System und folglich auf die kultivierten Astrozyten zu sehen.
Darüber hinaus ist diese Methode in hohem Maße an viele verschiedene wissenschaftliche Fragen zum mitochondrialen Verhalten und zu den Rollen in bestimmten Kontexten anpassbar. Hier befasst sich das skizzierte Protokoll speziell mit kultivierten Astrozyten. Es können jedoch viele andere Zelltypen verwendet werden, und die Behandlungen, die getestet werden können, sind nur durch die untersuchten Fragen begrenzt. Diese Art der Bildgebung hat das Potenzial, das kollektive Wissen und Verständnis des mitochondrialen Verhaltens, der zugrunde liegenden Mechanismen, die zu mitochondrialer Dysfunktion führen, und der Auswirkungen vieler Pathologien auf die angeborene Dynamik in verschiedenen Zelltypen zu verbessern.
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde durch ein Stipendium der Synapsis Foundation unterstützt, das an K.R. und das Universitätsspital Lausanne (CHUV) vergeben wurde. Die Autoren danken Nikon für ihre Hilfe, insbesondere J. Gannevat.
µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 – C13440-20CU | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |