Este protocolo describe un nuevo ensayo de potenciador transitorio-reportero basado en rAAV. Este ensayo se puede utilizar para inducir la expresión impulsada por potenciadores in vivo en el cerebro del ratón.
Los potenciadores son plataformas de unión para una amplia gama de factores de transcripción que impulsan patrones de expresión específicos de genes específicos de tejidos y tipos de células. Múltiples medios para evaluar el ADN no codificante y varios estados de cromatina han demostrado ser útiles para predecir la presencia de secuencias potenciadoras en el genoma, pero validar la actividad de estas secuencias y encontrar los órganos y las etapas de desarrollo en las que están activos es un proceso laborioso. Los avances recientes en vectores de virus adenoasociados (AAV) han permitido la entrega generalizada de transgenes a tejidos de ratón, lo que permite realizar pruebas de potenciadores in vivo sin necesidad de un animal transgénico. Este protocolo muestra cómo una construcción reportera que expresa EGFP bajo el control de un promotor mínimo, que no impulsa una expresión significativa por sí sola, puede usarse para estudiar los patrones de actividad de las secuencias de potenciadores candidatos en el cerebro del ratón. Una construcción de reportero empaquetada con AAV se entrega al cerebro del ratón y se incuba durante 1-4 semanas, después de lo cual se sacrifica al animal y se observan secciones cerebrales bajo un microscopio. EGFP aparece en células en las que el potenciador probado es suficiente para iniciar la expresión génica, señalando la ubicación y la etapa de desarrollo en la que el potenciador está activo en el cerebro. Los métodos de clonación estándar, el empaquetado de AAV de bajo costo y la expansión de los serotipos de AAV y los métodos para la administración in vivo y la lectura de imágenes estándar hacen de este un enfoque accesible para el estudio de cómo se regula la expresión génica en el cerebro.
Los potenciadores son elementos genómicos cis-reguladores que sirven como sitios de unión al factor de transcripción y pueden conducir la expresión de un gen diana de una manera espacio-temporal específica 1,2. Son diferencialmente activos en diferentes tipos celulares, tejidos y etapas de desarrollo y pueden ser sustratos de variación genómica relacionada con el riesgo de enfermedad 3,4. Por lo tanto, la necesidad de comprender la dinámica de la función potenciadora es fundamental para el progreso en las aplicaciones de la ciencia traslacional y básica dentro de la genómica. Las predicciones in silico de la actividad potenciadora pueden servir como excelentes recursos para generar hipótesis en cuanto a la capacidad potenciadora 5,6. Tal actividad potenciadora predicha puede requerir validación e interrogación adicionales para una comprensión completa de la actividad funcional. Los ensayos de Enhancer Reporter han demostrado ser valiosos para este propósito en una variedad de sistemas, desde células hasta animales 7,8,9. Con miras a extender estos estudios en un contexto transitorio videodan vivo flexible y rentable, este protocolo describe el uso de métodos in vivo basados en AAV para probar secuencias potenciadoras putativas por su capacidad para impulsar la expresión de un gen reportero ectópico en el cerebro postnatal del ratón. Esta familia de métodos tiene utilidad para interrogar secuencias candidatas individuales o cribado paralelo de bibliotecas y es relevante para la investigación básica y traslacional.
Este método combina en un solo plásmido una secuencia de ADN candidato potenciador putativo con un gen reportero (aquí EGFP), bajo el control de un promotor mínimo que por sí solo no impulsa una expresión significativa. El plásmido se empaqueta en AAV recombinante (rAAV) y se inyecta en un modelo animal. Si bien la aplicación aquí es al cerebro, varios serotipos de rAAV permiten la infección a través de diferentes tipos de tejidos, de modo que este enfoque puede extenderse a otros sistemas10. Después de un período de tiempo, el cerebro puede ser recolectado y ensayado para la expresión del gen reportero. La expresión fuerte, en comparación con los controles, indica que la secuencia candidata probada fue capaz de “mejorar” la expresión del gen (Figura 1). Este diseño simple ofrece un enfoque fácil y claro para probar una secuencia de actividad potenciadora in vivo en el cerebro.
Además de probar la capacidad potenciadora de una secuencia, este método se puede combinar con técnicas para determinar la actividad potenciadora del tipo celular. En los enfoques basados en secuencias para determinar la actividad potenciadora diferencial, la clasificación de células en marcadores específicos de tipo celular antes de la secuenciación de ADN y ARN puede permitir a los investigadores determinar si diferentes tipos de células muestran actividad potenciadora diferencial, como se describió en Gisselbrecht et al.11. En los enfoques basados en imágenes, el etiquetado conjunto de imágenes con marcadores específicos del tipo de célula permite examinar si las células que exhiben fluorescencia impulsada por potenciadores también muestran marcadores de tipo celular de interés 12,13,14,15,16. Los ensayos de reportero de potenciadores permiten realizar pruebas directas de la variación alélica asociada al riesgo en los potenciadores para detectar efectos sobre la capacidad del potenciador. La gran mayoría de los loci de riesgo identificados en los estudios de asociación de genoma completo (GWAS) se encuentran en regiones no codificantes del genoma17. Los estudios de anotación funcional de estos loci de riesgo indican que una gran parte probablemente actúa como potenciadores18,19,20. El despliegue de MPRA in vivo puede permitir probar estas variantes asociadas al riesgo para la actividad potenciadora en el cerebro12,21. Finalmente, la entrega y la recolección en diferentes puntos de tiempo pueden ofrecer información sobre las etapas de desarrollo durante las cuales un potenciador está activo.
Los diseños de plásmidos potenciadores-reporteros son diversos y se pueden personalizar para adaptarse a los objetivos experimentales. Hay varias opciones para promotores mínimos que se han utilizado en la investigación de potenciadores, como el promotor mínimo de β-globinahumana 22 y el promotor mínimo de ratón Hsp6823. Se sabe que estos promotores impulsan bajos niveles de expresión a menos que se combinen con un elemento potenciador para activarlos. En contraste, los elementos promotores constitutivos impulsan la expresión fuerte del transgén, útil para el control positivo o para probar la función potenciadora en un contexto de expresión robusta. Las opciones comunes para los promotores constitutivos incluyen CAG, un promotor híbrido derivado del promotor de β actina de pollo y el potenciador inmediato temprano del citomegalovirus24, o EF1α25 humano. Dado que se sabe que los potenciadores funcionan bidireccionalmente26, la orientación y la ubicación del potenciador en relación con el promotor mínimo son flexibles (Figura 2A). Los ensayos tradicionales de potenciador-reportero colocan el potenciador aguas arriba del promotor y, en las entregas de la biblioteca, incluyen una secuencia de código de barras aguas abajo del gen reportero para asociar las lecturas de secuenciación con el potenciador probado27. Sin embargo, los potenciadores también se pueden colocar en el marco de lectura abierto del gen reportero y servir como su propia secuencia de código de barras, como se hace en STARR-seq28. El protocolo descrito aquí utiliza el diseño del ensayo STARR-seq, colocando la secuencia del potenciador candidato en el UTR 3′ del gen reportero. Si bien la orientación STARR-seq ofrece el beneficio de una clonación más simplificada, es menos conocida que el enfoque convencional y puede inducir una estabilidad variable del ARN entre las construcciones. Los métodos descritos pueden adaptarse fácilmente a la orientación STARR-seq o convencional con alteraciones menores en el proceso de clonación que se han descrito en otra parte27,29.
Se pueden emplear diferentes métodos de administración de AAV para personalizar aún más esta técnica para que se ajuste a los objetivos experimentales (Figura 2B). Las inyecciones intracraneales directas, descritas más adelante en este protocolo, entregan una alta concentración de virus directamente al cerebro30. Esto proporciona una alta eficiencia de transducción centrada en el sitio de inyección, lo que la convierte en una excelente técnica para experimentos que buscan maximizar la densidad de las células transducidas sobre un área de tejido. La inyección estereotáctica puede ayudar a estandarizar el sitio de inyección en animales para la transducción localizada reproducible. Las inyecciones intracraneales son más sencillas en animales postnatales tempranos. Como técnica alternativa, las inyecciones sistémicas pueden entregar transgenes utilizando AAVs con serotipos capaces de cruzar la barrera hematoencefálica31. Las inyecciones en las venas de la cola permiten que el virus circule por todo el cuerpo, lo que permite la administración generalizada a través de muchos tejidos10. Las inyecciones retroorbitarias son otra técnica de inyección sistémica que libera el virus detrás del ojo en el seno retroorbitario32. Esto ofrece una ruta más directa para el AAV desde el sistema venoso hasta el cerebro, resultando en una mayor concentración de células transducidas en el cerebro que las inyecciones en vasos sanguíneos más periféricos33.
Otro aspecto flexible de esta técnica es el método de lectura. En términos generales, las opciones pueden describirse como basadas en reporteros o en secuenciación (Figura 2C). La incorporación de un reportero fluorescente como GFP en el marco de lectura abierto del constructo da como resultado la expresión de la proteína fluorescente en cualquier célula transducida donde el potenciador candidato impulsó la expresión. Las técnicas de etiquetado e imagen, como la inmunohistoquímica, permiten la amplificación de la señal. Las técnicas de lectura basadas en la secuenciación implican la identificación de secuencias de la construcción entregada en ARN recolectado del tejido. Al cuantificar la cantidad de ADN viral que se entregó inicialmente, la comparación del ARN expresado versus el ADN entregado se puede utilizar para determinar el grado en que una secuencia potenciadora probada fue capaz de impulsar una mayor expresión del transgén, por ejemplo, en el contexto de un ensayo de reportero masivamente paralelo (MPRA). Los MPRA ofrecen una poderosa expansión de estas técnicas para probar hasta miles de potenciadores candidatos para la actividad simultáneamente y se han descrito ampliamente en la investigación genómica 12,27,34,35,36. Se logra una mayor detección de rendimiento mediante la ejecución de pasos de clonación, empaquetado, entrega y secuenciación para los potenciadores candidatos en lotes en lugar de individualmente.
La selección del potenciador candidato ofrece otra oportunidad para la flexibilidad (Figura 2D). Por ejemplo, este ensayo se puede utilizar para identificar potenciadores de un gen específico, para determinar la función de las regiones de interés del ADN no codificante, o para determinar tipos específicos de células o etapas de desarrollo durante las cuales un potenciador está activo, todo lo cual sirve para objetivos tanto en la ciencia básica como en la investigación de enfermedades. En general, la selección del potenciador candidato está impulsada por predicciones in silico de la actividad del potenciador. Comúnmente, las predicciones in silico incluyen ChIP-seq para modificaciones de histonas que indican potenciadores probables, como H3K27ac37 y mapeo de accesibilidad de cromatina38. Finalmente, un área de investigación creciente es el cribado basado en funciones de elementos potenciadores diseñados sintéticamente, lo que permite estudios de cómo la secuencia de potenciadores dirige la función39 y el diseño de potenciadores con propiedades específicas40.
Este protocolo describe un método basado en rAAV para el despliegue de transgenes impulsados por potenciadores en el cerebro postnatal del ratón. En este protocolo generalizado, un potenciador candidato, un promotor mínimo, un gen reportero y una secuencia de código de barras opcional se clonan en una columna vertebral de plásmidos AAV. Estos experimentos se pueden hacer con una sola secuencia potenciadora candidata o con muchas secuencias en paralelo. El plásmido se empaqueta en un rAAV y se administra al cerebro …
The authors have nothing to disclose.
La secuenciación se realizó en el UC Davis DNA Technologies Core. Agradecemos al laboratorio de Lin Tian en UC Davis por la capacitación en el empaque de rAAV y por regalarnos generosamente plásmidos de AAV helper y rep / cap. Este trabajo fue apoyado por NIH/NIGMS R35GM119831.
10x Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | C9999-1000ML | |
5'-gatcactctcggcatggac-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: Custom designed | Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments. |
5'-gatggctggcaactagaagg-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: Custom designed | Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments. |
Agarose | VWR | VWRVN605-500G | |
Aspirator tube assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | for mouth-driven delivery of rAAV |
Bacteriological petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Carbenicillin | Sigma-Aldrich | C1389-5G | |
Chicken IgY anti-GFP | Thermo Fisher Scientific | A10262 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM900 | The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800. |
Conical centrifuge tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | 12-565-269 | |
Cryomolds | Thermo Fisher Scientific | NC9806558 | These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues. |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
Dissecting scissors, 4.5" | VWR | 82027-578 | |
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
Dulbecco's PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | MT21031CV | |
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 22431048 | |
Falcon round-bottom tubes 14 mL | Thermo Fisher Scientific | 352059 | |
Fast Green dye | Grainger | F0099-1G | |
Fine detail paint brush set | Artbrush Tower | B014GWCLFO | |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
Glass capillary tubes | Drummond Scientific Company | 5-000-2005 | |
HiSpeed Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12663 | Commercial plasmid maxi prep kit |
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water | VWR | SH30538.03 | |
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle | Thermo Fisher Scientific | 26708 | |
Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | Lint-free wipe |
LB Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar pre-mix for selective media |
McPherson Vannas iris scissor | Integra LifeSciences | 360-215 | |
Mineral oil | Sigma Life Science | 69794-500ML | |
NEB Stable Competent E. coli | NEB | C3040I | |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up | Takara | 740609.5 | Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction |
OCT medium | VWR | 25608-930 | |
Orbital shaker | Cole Parmer | 60-100 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
PCR strip tubes 0.2 mL | VWR | 490003-692 | |
Peristaltic pump | Gilson | F155005 | |
Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F549L | |
Powdered milk | Sunny Select | ||
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
rCutSmart Buffer | NEB | B6004S | Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI |
Restriction enzyme: AscI | NEB | R0558L | |
Restriction enzyme: PacI | NEB | R0547L | |
Restriction enzyme: XmaI | NEB | R0180L | |
SOC outgrowth medium | NEB | B0920S | Recovery medium after transformation |
Sucrose (RNase/DNase free) | Millipore Sigma | 033522.5KG | |
TAE buffer | Apex | 20-194 | |
Transfer tubing | Gilson | F1179941 | For peristaltic pump |
Triton X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Thermo Fisher Scientific | A1460 | Plasmid mini prep kit |