Ce protocole décrit un nouveau test d’amplificateur-rapporteur transitoire basé sur le rAAV. Ce test peut être utilisé pour induire une expression pilotée par l’amplificateur in vivo dans le cerveau de la souris.
Les amplificateurs sont des plates-formes de liaison pour un large éventail de facteurs de transcription qui conduisent à des modèles d’expression spécifiques de gènes spécifiques aux tissus et aux types cellulaires. De multiples moyens d’évaluer l’ADN non codant et divers états de chromatine se sont révélés utiles pour prédire la présence de séquences d’amplificateurs dans le génome, mais valider l’activité de ces séquences et trouver les organes et les stades de développement dans lesquels elles sont actives est un processus à forte intensité de main-d’œuvre. Les progrès récents dans les vecteurs de virus adéno-associés (AAV) ont permis la livraison généralisée de transgènes aux tissus de souris, permettant des tests d’amplificateur in vivo sans nécessiter un animal transgénique. Ce protocole montre comment une construction rapporteur qui exprime l’EGFP sous le contrôle d’un promoteur minimal, qui ne conduit pas d’expression significative par elle-même, peut être utilisée pour étudier les modèles d’activité des séquences d’amplificateurs candidats dans le cerveau de la souris. Une construction de rapporteur emballée AAV est livrée au cerveau de la souris et incubée pendant 1 à 4 semaines, après quoi l’animal est sacrifié et des sections de cerveau sont observées au microscope. L’EGFP apparaît dans les cellules dans lesquelles l’amplificateur testé est suffisant pour initier l’expression génique, en localisant l’emplacement et le stade de développement dans lequel l’amplificateur est actif dans le cerveau. Les méthodes de clonage standard, l’emballage AAV à faible coût, les sérotypes AAV en expansion et les méthodes d’administration in vivo et de lecture d’imagerie standard en font une approche accessible pour l’étude de la régulation de l’expression génique dans le cerveau.
Les amplificateurs sont des éléments cis-régulateurs génomiques qui servent de sites de liaison au facteur de transcription et peuvent conduire l’expression d’un gène cible d’une manière spatio-temporellement spécifique 1,2. Ils sont différentiellement actifs dans différents types de cellules, tissus et stades de développement et peuvent être des substrats de variation génomique liée au risque de maladie 3,4. Ainsi, la nécessité de comprendre la dynamique de la fonction de l’amplificateur est essentielle pour progresser dans les applications scientifiques translationnelles et fondamentales en génomique. Les prédictions in silico de l’activité de l’amplificateur peuvent constituer d’excellentes ressources pour générer des hypothèses quant à la capacité de l’amplificateur 5,6. Une telle activité d’amplificateur prévue peut nécessiter une validation et une interrogation supplémentaires pour une compréhension complète de l’activité fonctionnelle. Les tests de rapporteurs Enhancer se sont révélés utiles à cette fin dans une variété de systèmes, des cellules aux animaux 7,8,9. Afin d’étendre ces études dans un contexte transitoire in vivo flexible et rentable, ce protocole décrit l’utilisation de méthodes in vivo basées sur l’AAV pour tester des séquences d’amplificateurs putatifs pour leur capacité à conduire l’expression d’un gène rapporteur ectopique dans le cerveau postnatal de la souris. Cette famille de méthodes est utile pour interroger des séquences candidates uniques ou un criblage parallèle en bibliothèque et est pertinente pour la recherche fondamentale et translationnelle.
Cette méthode combine dans un seul plasmide une séquence d’ADN candidate amplificateur putative avec un gène rapporteur (ici EGFP), sous le contrôle d’un promoteur minimal qui seul ne conduit pas à une expression significative. Le plasmide est emballé dans un AAV recombinant (rAAV) et injecté dans un modèle animal. Bien que l’application ici soit au cerveau, divers sérotypes rAAV permettent l’infection à travers différents types de tissus afin que cette approche puisse être étendue à d’autres systèmes10. Après un certain temps, le cerveau peut être recueilli et analysé pour l’expression du gène rapporteur. Une forte expression, comparée à celle des témoins, indique que la séquence candidate testée a pu « améliorer » l’expression du gène (Figure 1). Cette conception simple offre une approche simple et claire pour tester une séquence d’activité d’amplificateur in vivo dans le cerveau.
En plus de tester la capacité d’amplificateur d’une séquence, cette méthode peut être combinée avec des techniques pour déterminer l’activité de l’amplificateur de type cellulaire. Dans les approches basées sur la séquence pour déterminer l’activité différentielle de l’amplificateur, le tri des cellules sur des marqueurs spécifiques au type cellulaire avant le séquençage de l’ADN et de l’ARN peut permettre aux chercheurs de déterminer si différents types de cellules montrent une activité d’amplificateur différentiel, comme cela a été décrit dans Gisselbrecht et coll.11. Dans les approches basées sur l’imagerie, le comarquage d’images avec des marqueurs spécifiques au type cellulaire permet d’examiner si les cellules présentant une fluorescence enhancer-driven présentent également des marqueurs de type cellulaire d’intérêt 12,13,14,15,16. Les tests de rapporteur d’amplificateur permettent de tester directement la variation allélique associée au risque dans les amplificateurs pour les effets sur la capacité de l’amplificateur. La grande majorité des loci de risque identifiés dans les études d’association pangénomique (GWAS) se trouvent dans des régions non codantes du génome17. Les études d’annotation fonctionnelle de ces loci de risque indiquent qu’une grande partie agit probablement comme amplificateurs18,19,20. Le déploiement de la MPRA in vivo peut permettre de tester ces variantes associées au risque pour l’activité d’amplificateur dans le cerveau12,21. Enfin, la livraison et la collecte à différents moments peuvent donner un aperçu des stades de développement au cours desquels un amplificateur est actif.
Les conceptions de plasmides amplificateurs-rapporteurs sont diverses et peuvent être personnalisées pour répondre aux objectifs expérimentaux. Il existe plusieurs options pour les promoteurs minimaux qui ont été utilisées dans la recherche sur les amplificateurs, telles que le promoteur minimal de la β-globinehumaine 22 et le promoteur minimal Hsp6823 de souris. Ces promoteurs sont connus pour conduire de faibles niveaux d’expression à moins qu’ils ne soient couplés à un élément amplificateur pour les activer. En revanche, les éléments promoteurs constitutifs entraînent une forte expression du transgène, utile pour le contrôle positif ou pour tester la fonction d’amplificateur dans un contexte d’expression robuste. Les choix courants pour les promoteurs constitutifs comprennent CAG, un promoteur hybride dérivé du promoteur de la β-actine de poulet et de l’amplificateur immédiat-précoce du cytomégalovirus24, ou EF1α25 humain. Étant donné que les amplificateurs sont connus pour fonctionner de manière bidirectionnelle26, l’orientation et l’emplacement de l’amplificateur par rapport au promoteur minimal sont flexibles (Figure 2A). Les tests traditionnels d’amplificateur-rapporteur placent l’amplificateur en amont du promoteur et, dans les livraisons en bibliothèque, incluent une séquence de codes-barres en aval du gène rapporteur pour associer les lectures de séquençage à l’amplificateurtesté 27. Cependant, les amplificateurs peuvent également être placés dans le cadre de lecture ouvert du gène rapporteur et servir de séquence de codes à barres, comme cela se fait dans STARR-seq28. Le protocole décrit ici utilise la conception du test STARR-seq, plaçant la séquence d’amplificateur candidat dans l’UTR 3′ du gène rapporteur. Bien que l’orientation STARR-seq offre l’avantage d’un clonage plus rationalisé, elle est moins bien comprise que l’approche conventionnelle et peut induire une stabilité variable de l’ARN entre les constructions. Les méthodes décrites peuvent être facilement adaptées à l’orientation STARR-seq ou conventionnelle avec des modifications mineures au processus de clonage qui ont été décrites ailleurs27,29.
Différentes méthodes d’administration d’AAV peuvent être utilisées pour personnaliser davantage cette technique afin qu’elle corresponde aux objectifs expérimentaux (Figure 2B). Les injections intracrâniennes directes, décrites plus loin dans ce protocole, délivrent une forte concentration de virus directement dans le cerveau30. Cela donne une efficacité de transduction élevée centrée sur le site d’injection, ce qui en fait une excellente technique pour les expériences cherchant à maximiser la densité des cellules transduites sur une zone de tissu. L’injection stéréotaxique peut aider à normaliser le site d’injection chez les animaux pour une transduction localisée reproductible. Les injections intracrâniennes sont plus simples chez les animaux postnataux précoces. Comme technique alternative, les injections systémiques peuvent délivrer des transgènes en utilisant des AAV avec des sérotypes capables de traverser la barrière hémato-encéphalique31. Les injections de veines de queue permettent au virus de circuler dans tout le corps, permettant une administration généralisée dans de nombreux tissus10. Les injections rétro-orbitales sont une autre technique d’injection systémique qui délivre le virus derrière l’œil dans le sinus rétro-orbitaire32. Cela offre une voie plus directe pour l’AAV du système veineux au cerveau, ce qui entraîne une concentration plus élevée de cellules transduites dans le cerveau que les injections dans des vaisseaux sanguins plus périphériques33.
Un autre aspect flexible de cette technique est la méthode de lecture. De façon générale, les options peuvent être décrites comme étant fondées sur le déclarant ou le séquençage (figure 2C). L’incorporation d’un rapporteur fluorescent tel que GFP dans le cadre de lecture ouvert de la construction entraîne l’expression de la protéine fluorescente dans toutes les cellules transduites où l’amplificateur candidat a entraîné l’expression. Les techniques de marquage et d’imagerie telles que l’immunohistochimie permettent l’amplification du signal. Les techniques de lecture basées sur le séquençage impliquent l’identification de séquences de la construction délivrée dans l’ARN prélevé dans le tissu. En quantifiant la quantité d’ADN viral initialement délivrée, la comparaison de l’ARN exprimé par rapport à l’ADN délivré peut être utilisée pour déterminer dans quelle mesure une séquence d’amplificateur testée était capable de conduire à une expression accrue du transgène, par exemple, dans le contexte d’un test de rapporteur massivement parallèle (MPRA). Les MPRA offrent une puissante expansion de ces techniques pour tester simultanément jusqu’à des milliers d’amplificateurs candidats et ont été largement décrits dans la recherche en génomique 12,27,34,35,36. Un criblage à débit plus élevé est obtenu en exécutant des étapes de clonage, d’empaquetage, de livraison et de séquençage pour les améliorateurs candidats par lots plutôt qu’individuellement.
La sélection d’un candidat amplificateur offre une autre possibilité de flexibilité (Figure 2D). Par exemple, ce test peut être utilisé pour identifier les amplificateurs d’un gène spécifique, pour déterminer la fonction des régions d’intérêt de l’ADN non codantes, ou pour déterminer des types de cellules spécifiques ou des stades de développement au cours desquels un amplificateur est actif – qui servent tous des objectifs à la fois en science fondamentale et en recherche sur les maladies. En général, la sélection des amplificateurs candidats est motivée par les prédictions in silico de l’activité de l’amplificateur. Généralement, les prédictions in silico incluent ChIP-seq pour les modifications des histones qui indiquent des amplificateurs probables, tels que H3K27ac37 et la cartographie de l’accessibilité de la chromatine38. Enfin, un domaine de recherche croissant est le criblage basé sur la fonction d’éléments amplificateurs synthétiques, permettant des études sur la façon dont la séquence d’amplificateurs dirige la fonction39 et la conception d’amplificateurs ayant des propriétés spécifiques40.
Ce protocole décrit une méthode basée sur rAAV pour le déploiement de transgènes pilotés par amplificateur dans le cerveau postnatal de la souris. Dans ce protocole généralisé, un amplificateur candidat, un promoteur minimal, un gène rapporteur et une séquence de codes-barres optionnelle sont clonés dans un squelette plasmidique AAV. Ces expériences peuvent être réalisées avec une seule séquence d’amplificateur candidat ou avec plusieurs séquences en parallèle. Le plasmide est emballé dans un rAAV e…
The authors have nothing to disclose.
Le séquençage a été effectué à l’UC Davis DNA Technologies Core. Nous remercions le laboratoire de Lin Tian à UC Davis pour la formation sur l’emballage rAAV et pour nous avoir généreusement offert des plasmides d’aide AAV et de rep/capuchon. Ce travail a été soutenu par NIH/NIGMS R35GM119831.
10x Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | C9999-1000ML | |
5'-gatcactctcggcatggac-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: Custom designed | Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments. |
5'-gatggctggcaactagaagg-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: Custom designed | Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments. |
Agarose | VWR | VWRVN605-500G | |
Aspirator tube assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | for mouth-driven delivery of rAAV |
Bacteriological petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Carbenicillin | Sigma-Aldrich | C1389-5G | |
Chicken IgY anti-GFP | Thermo Fisher Scientific | A10262 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM900 | The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800. |
Conical centrifuge tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | 12-565-269 | |
Cryomolds | Thermo Fisher Scientific | NC9806558 | These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues. |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
Dissecting scissors, 4.5" | VWR | 82027-578 | |
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
Dulbecco's PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | MT21031CV | |
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 22431048 | |
Falcon round-bottom tubes 14 mL | Thermo Fisher Scientific | 352059 | |
Fast Green dye | Grainger | F0099-1G | |
Fine detail paint brush set | Artbrush Tower | B014GWCLFO | |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
Glass capillary tubes | Drummond Scientific Company | 5-000-2005 | |
HiSpeed Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12663 | Commercial plasmid maxi prep kit |
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water | VWR | SH30538.03 | |
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle | Thermo Fisher Scientific | 26708 | |
Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | Lint-free wipe |
LB Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar pre-mix for selective media |
McPherson Vannas iris scissor | Integra LifeSciences | 360-215 | |
Mineral oil | Sigma Life Science | 69794-500ML | |
NEB Stable Competent E. coli | NEB | C3040I | |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up | Takara | 740609.5 | Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction |
OCT medium | VWR | 25608-930 | |
Orbital shaker | Cole Parmer | 60-100 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
PCR strip tubes 0.2 mL | VWR | 490003-692 | |
Peristaltic pump | Gilson | F155005 | |
Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F549L | |
Powdered milk | Sunny Select | ||
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
rCutSmart Buffer | NEB | B6004S | Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI |
Restriction enzyme: AscI | NEB | R0558L | |
Restriction enzyme: PacI | NEB | R0547L | |
Restriction enzyme: XmaI | NEB | R0180L | |
SOC outgrowth medium | NEB | B0920S | Recovery medium after transformation |
Sucrose (RNase/DNase free) | Millipore Sigma | 033522.5KG | |
TAE buffer | Apex | 20-194 | |
Transfer tubing | Gilson | F1179941 | For peristaltic pump |
Triton X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Thermo Fisher Scientific | A1460 | Plasmid mini prep kit |