يصف هذا البروتوكول مقايسة مراسل محسن عابر جديد قائم على rAAV. يمكن استخدام هذا الفحص للحث على التعبير المدفوع بالمحسن في الجسم الحي في دماغ الفأر.
المعززات هي منصات ملزمة لمجموعة متنوعة من عوامل النسخ التي تقود أنماط تعبير محددة للجينات الخاصة بالأنسجة والخلايا. أثبتت الوسائل المتعددة لتقييم الحمض النووي غير المشفر وحالات الكروماتين المختلفة فائدتها في التنبؤ بوجود تسلسلات معززة في الجينوم ، ولكن التحقق من صحة نشاط هذه التسلسلات وإيجاد الأعضاء ومراحل النمو التي تنشط فيها هي عملية كثيفة العمالة. مكنت التطورات الحديثة في ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAV) من توصيل جينات التحوير على نطاق واسع إلى أنسجة الفئران ، مما مكن من اختبار محسن في الجسم الحي دون الحاجة إلى معدل وراثيا. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام بنية المراسل التي تعبر عن EGFP تحت سيطرة الحد الأدنى من المروج ، والتي لا تقود تعبيرا مهما من تلقاء نفسها ، لدراسة أنماط نشاط تسلسل محسن المرشح في دماغ الفأر. يتم تسليم بناء مراسل معبأ AAV إلى دماغ الفأر وحضنه لمدة 1-4 أسابيع ، وبعد ذلك يتم التضحية بالحيوان ، ويتم ملاحظة أقسام الدماغ تحت المجهر. يظهر EGFP في الخلايا التي يكون فيها المحسن الذي تم اختباره كافيا لبدء التعبير الجيني ، مع تحديد الموقع ومرحلة النمو التي ينشط فيها المحسن في الدماغ. إن طرق الاستنساخ القياسية ، وتغليف AAV منخفض التكلفة ، وتوسيع الأنماط المصلية AAV وطرق التوصيل في الجسم الحي وقراءات التصوير القياسية تجعل هذا نهجا متاحا لدراسة كيفية تنظيم التعبير الجيني في الدماغ.
المعززات هي عناصر تنظيمية جينومية لرابطة الدول المستقلة تعمل كمواقع ربط عامل النسخ ويمكنها دفع التعبير عن الجين المستهدف بطريقة محددة زمانيا مكانيا 1,2. وهي نشطة بشكل تفاضلي في أنواع الخلايا والأنسجة ومراحل التطور المختلفة ويمكن أن تكون ركائز للاختلاف الجينومي المرتبط بمخاطر المرض 3,4. وبالتالي ، فإن الحاجة إلى فهم ديناميكيات وظيفة المحسن أمر بالغ الأهمية للتقدم في كل من التطبيقات العلمية الانتقالية والأساسية في علم الجينوم. في السيليكو ، يمكن أن تكون تنبؤات نشاط المحسن بمثابة موارد ممتازة لتوليد فرضيات حول قدرة المحسن 5,6. يمكن أن يتطلب نشاط المحسن المتوقع هذا التحقق والاستجواب الإضافي لفهم كامل للنشاط الوظيفي. أثبتت فحوصات مراسل Enhancer أنها ذات قيمة لهذا الغرض عبر مجموعة متنوعة من الأنظمة ، من الخلايا إلى الحيوانات7،8،9. من أجل توسيع هذه الدراسات في سياق عابر مرن وفعال من حيث التكلفة في الجسم الحي ، يصف هذا البروتوكول استخدام الأساليب القائمة على AAV في الجسم الحي لاختبار تسلسلات المحسن المفترض لقدرتها على دفع التعبير عن جين مراسل خارج الرحم في دماغ الفأر بعد الولادة. هذه المجموعة من الأساليب لها فائدة لاستجواب تسلسل مرشح واحد أو فحص المكتبة المتوازي وهي ذات صلة بالبحوث الأساسية والانتقالية.
تجمع هذه الطريقة في بلازميد واحد تسلسل الحمض النووي المرشح المفترض مع جين مراسل (هنا EGFP) ، تحت سيطرة مروج الحد الأدنى الذي وحده لا يقود تعبيرا مهما. يتم تعبئة البلازميد في AAV المؤتلف (rAAV) وحقنه في نموذج حيواني. في حين أن التطبيق هنا هو الدماغ ، فإن الأنماط المصلية المختلفة rAAV تمكن العدوى عبر أنواع الأنسجة المختلفة بحيث يمكن توسيع هذا النهج ليشمل أنظمة أخرى10. بعد فترة من الزمن ، يمكن جمع الدماغ وفحصه للتعبير عن جين المراسل. يشير التعبير القوي ، مقارنة بالضوابط ، إلى أن تسلسل المرشح الذي تم اختباره كان قادرا على “تعزيز” التعبير عن الجين (الشكل 1). يوفر هذا التصميم البسيط نهجا سهلا وواضحا لاختبار تسلسل لنشاط المحسن في الجسم الحي في الدماغ.
بالإضافة إلى اختبار قدرة المحسن للتسلسل ، يمكن دمج هذه الطريقة مع تقنيات لتحديد نشاط محسن نوع الخلية. في النهج القائمة على التسلسل لتحديد نشاط المحسن التفاضلي ، يمكن أن يسمح فرز الخلايا على علامات خاصة بنوع الخلية قبل تسلسل الحمض النووي والحمض النووي الريبي للباحثين بتحديد ما إذا كانت أنواع الخلايا المختلفة تظهر نشاط محسن تفاضلي ، كما هو موضح في Gisselbrecht et al.11. في النهج القائمة على التصوير ، يسمح وضع العلامات المشتركة للصور مع علامات خاصة بنوع الخلية بفحص ما إذا كانت الخلايا التي تظهر مضان مدفوع بالمحسن تعرض أيضا علامات من نوع الخلية ذات الأهمية12،13،14،15،16. تتيح مقايسات مراسل المحسن الاختبار المباشر للتباين الأليل المرتبط بالمخاطر في المعززات للتأثيرات على قدرة المحسن. تقع الغالبية العظمى من مواقع الخطر المحددة في دراسات الارتباط على مستوى الجينوم (GWAS) في مناطق غير مشفرة من الجينوم17. تشير دراسات التعليقات التوضيحية الوظيفية لمواقع المخاطر هذه إلى أن جزءا كبيرا من المحتمل أن يعمل كمحسنات18،19،20. يمكن أن يسمح نشر MPRA في الجسم الحي باختبار هذه المتغيرات المرتبطة بالمخاطر لنشاط المحسن في الدماغ12,21. أخيرا ، يمكن أن يقدم التسليم والتجميع في نقاط زمنية مختلفة نظرة ثاقبة لمراحل التطور التي يكون خلالها المحسن نشطا.
تصميمات البلازميد المحسنة-المراسل متنوعة ويمكن تخصيصها لتناسب الأهداف التجريبية. هناك العديد من الخيارات للحد الأدنى من المروجين التي تم استخدامها في أبحاث المحسن ، مثل المروج الأدنى β-globinالبشري 22 والماوس Hsp68 الحد الأدنى من المروج23. من المعروف أن هؤلاء المروجين يقودون مستويات منخفضة من التعبير ما لم يقترن بعنصر محسن لتنشيطهم. في المقابل ، تدفع عناصر المروج التأسيسية تعبيرا قويا عن جين التحوير ، وهو مفيد للتحكم الإيجابي أو لاختبار وظيفة المحسن على خلفية التعبير القوي. تشمل الخيارات الشائعة للمروجين التأسيسيين CAG ، وهو مروج هجين مشتق من مروج الدجاج β الأكتين ومحسن الفيروس المضخم للخلايا الفوريالمبكر 24 ، أو EF1α25 البشري. نظرا لأنه من المعروف أن المعززات تعمل ثنائي الاتجاه26 ، فإن اتجاه وموقع المحسن بالنسبة إلى الحد الأدنى من المروج مرن (الشكل 2 أ). تضع مقايسات المحسن والمراسل التقليدية المحسن في المنبع للمروج ، وفي عمليات تسليم المكتبة ، تتضمن تسلسل الباركود في اتجاه مجرى جين المراسل لربط قراءات التسلسل بالمحسنالمختبر 27. ومع ذلك ، يمكن أيضا وضع المعززات في إطار القراءة المفتوح لجين المراسل وتعمل كتسلسل باركود خاص بها ، كما هو الحال في STARR-seq28. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا تصميم مقايسة STARR-seq ، مما يضع تسلسل محسن المرشح في 3 ‘UTR لجين المراسل. في حين أن اتجاه STARR-seq يوفر ميزة الاستنساخ الأكثر انسيابية ، إلا أنه أقل فهما من النهج التقليدي وقد يؤدي إلى استقرار متغير للحمض النووي الريبي بين البنى. يمكن تكييف الطرق الموصوفة بسهولة إما مع STARR-seq أو الاتجاه التقليدي مع تعديلات طفيفة على عملية الاستنساخ التي تم وصفها في مكان آخر27,29.
يمكن استخدام طرق مختلفة لتسليم AAV لزيادة تخصيص هذه التقنية لتناسب الأهداف التجريبية (الشكل 2 ب). الحقن المباشر داخل الجمجمة ، الموصوف بمزيد من التفصيل في هذا البروتوكول ، يقدم تركيزا عاليا من الفيروس مباشرة إلى الدماغ30. وهذا يعطي كفاءة نقل عالية تتمركز في موقع الحقن ، مما يجعل هذه تقنية ممتازة للتجارب التي تتطلع إلى زيادة كثافة الخلايا المنقولة إلى أقصى حد على مساحة من الأنسجة. يمكن أن يساعد الحقن التجسيمي في توحيد موقع الحقن عبر الحيوانات من أجل النقل الموضعي القابل للتكرار. الحقن داخل الجمجمة هي الأكثر وضوحا في الحيوانات بعد الولادة المبكرة. كتقنية بديلة ، يمكن للحقن الجهازية توصيل جينات التحوير باستخدام AAVs مع الأنماط المصلية القادرة على عبور الحاجز الدموي الدماغي31. تسمح حقن الوريد الذيل للفيروس بالانتشار في جميع أنحاء الجسم ، مما يتيح التوصيل المعمم عبر العديد من الأنسجة10. الحقن المداري الخلفي هي تقنية حقن جهازية أخرى توصل الفيروس خلف العين إلى الجيب المداريالخلفي 32. يوفر هذا طريقا مباشرا أكثر ل AAV من الجهاز الوريدي إلى الدماغ ، مما يؤدي إلى تركيز أعلى للخلايا المنقولة في الدماغ مقارنة بالحقن في المزيد من الأوعية الدموية المحيطية33.
جانب مرن آخر لهذه التقنية هو طريقة القراءة. بشكل عام ، يمكن وصف الخيارات بأنها قائمة على المراسل أو قائمة على التسلسل (الشكل 2 ج). يؤدي دمج مراسل فلوري مثل GFP في إطار القراءة المفتوح للبناء إلى التعبير عن البروتين الفلوري في أي خلايا محولة حيث قاد المحسن المرشح التعبير. تتيح تقنيات وضع العلامات والتصوير مثل الكيمياء المناعية تضخيم الإشارة. تتضمن تقنيات القراءة القائمة على التسلسل تحديد التسلسلات من البنية المسلمة في الحمض النووي الريبي التي تم جمعها من الأنسجة. من خلال تحديد كمية الحمض النووي الفيروسي التي تم تسليمها في البداية ، يمكن استخدام مقارنة الحمض النووي الريبي المعبر عنه مقابل الحمض النووي المنقول لتحديد الدرجة التي كان بها تسلسل محسن تم اختباره قادرا على زيادة التعبير عن جين التحوير ، على سبيل المثال ، في سياق مقايسة مراسل موازية على نطاق واسع (MPRA). تقدم MPRAs توسعا قويا لهذه التقنيات لاختبار ما يصل إلى الآلاف من المعززات المرشحة للنشاط في وقت واحد وقد تم وصفها على نطاق واسع في أبحاث الجينوم12،27،34،35،36. يتم تحقيق فحص إنتاجية أعلى من خلال تنفيذ خطوات الاستنساخ والتعبئة والتسليم والتسلسل للمحسنات المرشحة دفعة واحدة وليس بشكل فردي.
يوفر اختيار محسن المرشح فرصة أخرى للمرونة (الشكل 2D). على سبيل المثال ، يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد معززات جين معين ، للتأكد من وظيفة مناطق الحمض النووي غير المشفرة ذات الأهمية ، أو لتحديد أنواع معينة من الخلايا أو مراحل النمو التي يكون خلالها المحسن نشطا – وكلها تخدم أهدافا في كل من العلوم الأساسية وأبحاث الأمراض. بشكل عام ، يكون اختيار محسن المرشح مدفوعا بتنبؤات السيليكو لنشاط المحسن. بشكل عام ، في تنبؤات السيليكو تشمل ChIP-seq لتعديلات هيستون التي تشير إلى معززات محتملة ، مثل H3K27ac37 ورسم خرائط إمكانية الوصول إلى الكروماتين38. أخيرا ، هناك مجال متزايد للبحث هو الفحص القائم على الوظيفة لعناصر المحسن المصممة صناعيا ، مما يتيح إجراء دراسات حول كيفية توجيه تسلسل المحسن للوظيفة39 وتصميم المعززات ذات الخصائص المحددة40.
يصف هذا البروتوكول طريقة قائمة على rAAV لنشر جينات التحوير التي يحركها المحسن في دماغ الفأر بعد الولادة. في هذا البروتوكول المعمم ، يتم استنساخ محسن مرشح ، ومروج بسيط ، وجين مراسل ، وتسلسل باركود اختياري في العمود الفقري البلازميد AAV. يمكن إجراء هذه التجارب باستخدام تسلسل محسن مرشح واحد أو ب?…
The authors have nothing to disclose.
تم إجراء التسلسل في مركز تقنيات الحمض النووي بجامعة كاليفورنيا في ديفيس. نشكر مختبر لين تيان في جامعة كاليفورنيا في ديفيس على التدريب على تغليف rAAV وإهدائنا بسخاء مساعد AAV وبلازميدات مندوب / غطاء. تم دعم هذا العمل من قبل NIH / NIGMS R35GM119831.
10x Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | C9999-1000ML | |
5'-gatcactctcggcatggac-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: Custom designed | Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments. |
5'-gatggctggcaactagaagg-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: Custom designed | Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments. |
Agarose | VWR | VWRVN605-500G | |
Aspirator tube assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | for mouth-driven delivery of rAAV |
Bacteriological petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Carbenicillin | Sigma-Aldrich | C1389-5G | |
Chicken IgY anti-GFP | Thermo Fisher Scientific | A10262 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM900 | The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800. |
Conical centrifuge tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | 12-565-269 | |
Cryomolds | Thermo Fisher Scientific | NC9806558 | These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues. |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
Dissecting scissors, 4.5" | VWR | 82027-578 | |
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
Dulbecco's PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | MT21031CV | |
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 22431048 | |
Falcon round-bottom tubes 14 mL | Thermo Fisher Scientific | 352059 | |
Fast Green dye | Grainger | F0099-1G | |
Fine detail paint brush set | Artbrush Tower | B014GWCLFO | |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
Glass capillary tubes | Drummond Scientific Company | 5-000-2005 | |
HiSpeed Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12663 | Commercial plasmid maxi prep kit |
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water | VWR | SH30538.03 | |
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle | Thermo Fisher Scientific | 26708 | |
Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | Lint-free wipe |
LB Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar pre-mix for selective media |
McPherson Vannas iris scissor | Integra LifeSciences | 360-215 | |
Mineral oil | Sigma Life Science | 69794-500ML | |
NEB Stable Competent E. coli | NEB | C3040I | |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up | Takara | 740609.5 | Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction |
OCT medium | VWR | 25608-930 | |
Orbital shaker | Cole Parmer | 60-100 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
PCR strip tubes 0.2 mL | VWR | 490003-692 | |
Peristaltic pump | Gilson | F155005 | |
Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F549L | |
Powdered milk | Sunny Select | ||
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
rCutSmart Buffer | NEB | B6004S | Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI |
Restriction enzyme: AscI | NEB | R0558L | |
Restriction enzyme: PacI | NEB | R0547L | |
Restriction enzyme: XmaI | NEB | R0180L | |
SOC outgrowth medium | NEB | B0920S | Recovery medium after transformation |
Sucrose (RNase/DNase free) | Millipore Sigma | 033522.5KG | |
TAE buffer | Apex | 20-194 | |
Transfer tubing | Gilson | F1179941 | For peristaltic pump |
Triton X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Thermo Fisher Scientific | A1460 | Plasmid mini prep kit |