前駆体同位体標識とアイソバリックタグ(cPILOT)は、利用可能なアイソバリックタグで同時に分析できるサンプル数を増やすことができる、強化されたサンプル多重化戦略です。ロボットプラットフォームの組み込みにより、実験のスループット、再現性、定量的精度が大幅に向上しました。
我々は、高スループット定量プロテオミクスワークフローを導入し、タンデム質量タグまたは等圧N、N-ジメチルロイシン等圧タグをそれぞれ有する最大22または24サンプルの多重化が可能な前駆体同位体標識および同等圧タグ(cPILOT)を組み合わせた。この強化されたサンプル多重化は質量分析の獲得時間をかなり減らし、高価な商業イソバリック試薬の有用性を高める。ただし、この戦略のサンプル処理とピペッティング手順の手動プロセスは、労力を要し、時間がかかり、サンプルロスと定量誤差を発生させる可能性があります。これらの制限は、自動化の組み込みによって克服することができます。ここでは、手動cPILOTプロトコルを、大量のサンプル数(すなわち96サンプル)を並列に調製できる自動液体処理装置に移しました。全体的に、自動化はcPILOTの実現可能性および再現性を高め、同等のオートメーション装置を有する他の研究者による広い使用法を可能にする。
質量分析(MS)ベースのプロテオミクスは、疾患特有のバイオマーカーの同定、疾患進行の理解、治療開発のリードの創出に欠かせない研究ツールです。これは、血清/血漿、近位体液、および組織1、2などの疾患関連の臨床サンプルの範囲から達成することができる。プロテオミクスバイオマーカーの発見と検証は、サンプル多重化戦略3,4のパワーのために最近大きな検討を得ています。サンプル多重法は、単一のMSインジェクション5,6内で2つ以上のサンプル条件を同時に比較および定量できる技術である。サンプル多重化は、化学、酵素、または代謝タグを含む複数のサンプルからペプチドまたはタンパク質をバーコード化し、1回のMSまたはMS/MS実験ですべてのサンプルからMS情報を取得することによって達成されます。利用可能なアイソバリックタグの中には、イソバリックタグ付け試薬(iTRAQ)、市販のタンデム質量タグ(TMT)、および16-plex7および21-plex8までの機能を持つ家庭用合成イソバリックN、N-ジメチルロイシン(DiLeu)試薬があります。
前駆体同位体標識と同等圧タグ付け(cPILOT)は、多重化技術の強化されたサンプルです。cPILOTは、TMTを使用した後の高pH(8.5)同等体標識に使用できるリジン残基を維持する低pH(〜2.5)のペプチドN末語の同位体標識を光[−(CH3)2]および重い[−−13C2H3)2]に結合する。 DiLeu、またはiTRAQタグ3、9、10、11、12、13、14。cPILOT戦略の二重標識スキームは、例えばペプチドを用いた2つのサンプルを用いた補足図1に描かれている。MS2レベルでのTMTベース定量の精度と精度は、干渉効果15と呼ばれる汚染共分離および共断片化されたイオンの存在により損なわれる可能性がある。不正確なレポーターイオン比のこの制限は、トリブリッドオービトラップ質量分析計の助けを借りて克服することができます。例えば、干渉効果は、質量分析計でMS1レベルのジメチル化対でピークを単離し、直線イオントラップでMS2断片化に光または重いピークを施し、HCD-MS3に最も強いMS2断片を施して定量的情報を得ることによって克服することができる。レポーターイオンを生成するために利用できるリジンアミンを使用せずにペプチドを選択する機会を増やすために、y-1フラグメントに基づく選択的MS3取得も使用でき、cPILOT9で定量可能なペプチドの割合が高くなるアプローチである。軽いラベルと重いラベリングの組み合わせは、個々のアイソバリックタグで達成される2倍の倍率でサンプル多重化能力を増加させます。我々は最近、diLeu試薬16との単一の実験で最大24のサンプルを組み合わせるためにcPILOTを使用しました。さらにcPILOTは、タンパク質ニトレーション17を含む酸化的翻訳後修飾14、他のグローバルプロテオーム9を研究するために使用され、アルツハイマー病マウスモデル11における複数の組織サンプルにわたる応用を実証している。
堅牢なサンプル調製は、cPILOT実験の重要なステップであり、時間がかかり、手間がかかり、広範囲に及ぶ可能性があります。強化されたサンプル多重化には、広範なピペット処理と高度に熟練した研究室の人員が必要であり、実験の再現性に大きく影響する要因がいくつかあります。例えば、サンプルの慎重な取り扱いは、すべてのサンプルに対して同様の反応時間を確保し、軽く、重いジメチル化されたサンプルのための適切な緩衝液pHを維持するために必要である。さらに、数十から数百のサンプルの手動調製は、高い実験誤差を導入することができます。そこで、サンプル調製のばらつきを低減し、定量的精度を向上させ、実験スループットを向上させるため、自動化されたcPILOTワークフローを開発しました。自動化は、ワークフローの多くの側面を完了できるロボット液体ハンドリング装置を使用して達成される(図1)。タンパク質定量からペプチド標識までのサンプル調製を、自動液体ハンドラ上で行った。自動液体ハンドラは、固相抽出(SPE)プレート、軌道シェーカー、および冷暖房装置との間のバッファ交換用の正圧装置(PPA)と統合されています。ロボットプラットフォームは、プレートとバッファに対応する28のデッキ位置を含みます。デッキの位置の版を移すグリッパーが付いている2つのポッドがある:96チャネル固定容積のピペットリングヘッド(5-1100 μL)および8チャネル可変容積の調査(1-1000 μL)。ロボットプラットフォームはソフトウェアを使用して制御されます。ロボット液体ハンドラを使用する前に、ユーザーは専門的に訓練を受ける必要があります。本研究では、1つのバッチで12以上のサンプルを処理するために労力を要する手動cPILOTワークフローを自動化することに焦点を当てています。cPILOTアプローチ11のスループットを向上させるために、cPILOTプロトコルをロボット液体ハンドラに移し、10以上のサンプルを並列に処理した。また、この自動化により、サンプル調製プロセスのさまざまなステップで各サンプルに対して同様の反応が可能となり、高度な訓練を受けたユーザーは手動のcPILOT中に達成する必要がありました。このプロトコルは、cPILOTを実行する自動液体処理装置の実装に焦点を当てています。本研究では、この自動化システムを使用するためのプロトコルを説明し、マウス肝ホモジナートの22プレックス「概念実証」分析を使用してその性能を実証する。
cPILOT は、1 回の実験で最大 24 個のサンプルを分析できる、拡張多重化戦略です。多重化容量は、使用可能な同位体および同位体のタグ付けの組み合わせの数によって異なります。TMTpro7の導入は、1回の実験で16個のサンプルをタグ付けすることができるが、cPILOTの限界を32-plexに押し上げることができる。cPILOTは複数のピペットステップで構成され、サンプル調製を行うために広範な注意とユーザーのスキルを必要とします。エキスパートユーザーでも、手動エラーは避けられず、ロボットプラットフォームを使用してcPILOT戦略のサンプルを処理します。cPILOTはペプチドのpH依存的なタグ付けを利用するので、pHは光および重いジメチル化されたサンプルのセットのために維持される必要がある。軽度の酸性塩基性pHは、N末分およびリジン残基の両方のジメチル化をもたらすことができます。cPILOTの利点は、ペプチドN末端がジメチル基で占められるため、イソバリックタグの半分しか必要としないためです。これにより、より多くのサンプルを半分のコストでラベル付けできます。より大きなサンプル数を処理するには、試薬の暴露時間がバッチ内の最初のサンプルと最後のサンプルに対して類似している必要があります。最大32個のサンプルを並列に収容できるピペットディスペンサーは、ロボット液体ハンドリングデバイスを使用することで最適に達成できます。
cPILOTで複数のサンプルを処理するために、手動ワークフローは自動化を組み込むために修正されました。この研究で使用されるロボット液体ハンドラは、96チャンネルと8チャンネルピペット能力を持つ2つのポッドを備えており、グリッパーは利用可能な28デッキの場所にプレートを配置します。液体ハンドラは、陽圧装置、軌道シェーカー、および96ウェルプレートのサンプルを加熱/冷却する装置と統合されています。正圧装置は、クリーンアップ中にSPEプレートでのバッファ交換を補助し、軌道シェーカーはサンプルの渦/混合に役立ちます。ロボットプラットフォームは、バッファとサンプルを96ウェルプレート、インキュベート、渦サンプル、および転写プレートに吸引し、分配するようにプログラムされました。アセトニトリルや水など、粘度が異なる液体は、この方法にプログラムすることもできる特定のピペット処理の考慮事項を必要とします。
cPILOTワークフローは、BCAによるタンパク質定量から、ペプチドをアイソバリックタグ(すなわちTMT)で標識することまで、液体ハンドラシステム上で行った。完全なプロトコルは、ウェルあたり2 mLを保持できる96の深い井戸プレートを使用するようにスケーリングされました。実験開始前にバッファーを用意し、並列サンプル処理を可能にするように96ウェルプレートに添加した。本研究では、マウス肝臓ホモジネートの22のワークフロー複製を深いウェルプレートに添加し、cPILOTプロトコルを介して取られた。最後に、22-plex等量マウス肝臓タグ付きペプチドからなる単一サンプルを質量分析計に注入した。サンプル中のペプチドの存在量に対応するレポーターイオン強度は、液体ハンドラで処理されたサンプルが手動プロトコル(図示されていないデータ)よりも低いCVを有することを示した。ロボットプラットフォームもサンプル処理の再現性を大幅に向上させました。再現性と堅牢性は、多数のサンプルを処理しながら非常に重要な要素です。ピペットエラーはデータの完全な誤解釈につながる可能性があり、ここではロボットプラットフォームが低いサンプル間変動を提供しました。また、ロボットプラットフォームを使用してcPILOTを行い、サンプルの準備に必要な時間を短縮しました。例えば、自動化された方法を開発した後、手動cPILOTの場合は7.5hと比較して22サンプルを処理するために2.5時間が必要でした。本マニュアルと自動のcPILOTワークフローの比較をさらに評価するための実験が当研究室で行われています。当研究室からの以前の報告に基づいて、手動cPILOTのタンパク質レポーターイオン強度のCV%は平均20%であり、外れ値がこの値12を超えた。
cPILOTは、細胞、組織、体液などの任意のサンプルタイプに使用することができるペプチドレベルでの化学的誘導体化戦略です。cPILOTは、サンプル多重化を強化し、自動化を組み込むことで、プロテオミクスにおけるハイスループットサンプル多重化を容易にします。このスループットは、さらに疾患と生物学的理解とバイオマーカー発見を進めるために必要です。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、RASRにヴァンダービルト大学スタートアップファンドとNIH賞(R01GM117191)を認めている。
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
Tris | Biorad | 161-0716 | |
Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
Urea | Biorad | 161-0731 | |
Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |