组合前体同位素标记和同位素标记 (cPILOT) 是一种增强的样品多路复用策略,能够增加可与可用同位素标记同时分析的样本数量。机器人平台的整合大大提高了实验的吞吐量、可重复性和定量精度。
我们引入了高通量定量蛋白质组学工作流程,组合前体同位素标记和同位素标记(cPILOT),能够在单个实验中分别用串联质量标记或正半核 N、N-二甲基利素等水标记进行多路复用多达 22 或 24 个样本。这种增强的样品多路复用大大缩短了质谱采集时间,并增加了昂贵的商用等量试剂的效用。然而,策略中样品处理和移液步骤的手动过程可能耗费大量,耗时,并引入样品丢失和定量误差。这些限制可以通过结合自动化来克服。在这里,我们将手动 cPILOT 协议转移到一个自动液体处理设备,可以并行准备大量样品(即 96 个样本)。总体而言,自动化提高了cPILOT的可行性和可重复性,并允许具有可比自动化设备的其他研究人员广泛使用。
基于质谱 (MS) 的蛋白质组学是识别疾病特定生物标志物、了解疾病进展和为治疗开发创造线索不可或缺的研究工具。这可以从一系列与疾病相关的临床样本,如血清/血浆,近源液和组织1,2。蛋白质组学生物标志物的发现和验证最近得到了重要的考虑,由于样品多路复用策略3,4的力量。样品多路复用是一种技术,可以同时比较和定量在单个MS注射5,6中两个或两个多个样本条件。样品多路复用是通过用化学、酶或代谢标签从多个样品中条形码肽或蛋白质,并在单个 MS 或 MS/MS 实验中从所有样品获取 MS 信息实现的。其中可用的等量标记试剂(iTRAQ),商业串联质量标签(TMT),和内部合成的等量N,N-二甲基柳辛(DiLeu)试剂的能力分别高达16丛7和21-丛8。
组合前体同位素标记和同位素标记 (cPILOT) 是一种增强的样品多路复用技术。cPILOT 结合了肽 N-termini 的同位素标记与轻 [(CH3)2]和重 [(13C2H3)2]同位素在低 pH (∼2.5), 使裂氨酸残留物可用于后续的高 pH (8.5) 同位素标签使用 TMT, DiLeu,或 iTRAQ 标记3,9,10,11,12,13,14。cPILOT 策略的双标记方案在附加图 1 中描述,其中两个样本使用示例肽。基于TMT的MS2水平定量的精度和精度可能会受到影响,因为存在称为干扰效应15的污染共隔离和共分离离子。在不准确的记者离子比的这种限制,可以克服与tribrid轨道质量光谱仪的帮助。例如,可以通过在质谱仪的MS1水平上隔离一个二甲基化对中的峰,在线性离子陷阱中将轻或重峰分段分段,然后为HCD-MS3进行最强烈的MS2碎片来获取定量信息,来克服干扰效应。为了增加选择无裂氨酸胺的肽的机会,可以生成报告离子,也可以使用基于y-1片段的选择性MS3采集,这种方法可导致cPILOT9可量化的肽比例更高。轻标签和重标签的组合将样品多路复用功能增加 2 倍,而单个等值标签可达到这一功能。我们最近使用cPILOT将多达24个样品结合在一次实验中与DiLeu试剂16。此外,cPILOT还用于研究氧化后转化后修饰14,包括蛋白质硝化17,其他全球蛋白质组9,并演示了在阿尔茨海默病小鼠模型11中的多个组织样本的应用。
可靠的样品制备是 cPILOT 实验中的关键步骤,既耗时又费力且范围广泛。增强型样品多路复用需要大量的移液和高度熟练的实验室人员,有几个因素可以严重影响实验的可重复性。例如,必须仔细处理样品,以确保所有样品的反应时间相似,并维持轻和重二甲基化样品的适当缓冲pH值。此外,手动制备数十至数百个样品可引入高实验误差。因此,为了减少样品制备的可变性,提高定量精度,提高实验吞吐量,我们开发了自动化的cPILOT工作流程。自动化是使用机器人液体处理装置实现的,该装置可以完成工作流程的许多方面(图1)。在自动液体处理机上进行了从蛋白质定量到肽标记的样品制备。自动液体处理机与正压装置 (PPA) 集成,用于固相提取 (SPE) 板、轨道摇床和加热/冷却装置之间的缓冲交换。机器人平台包含 28 个甲板位置,可容纳板和缓冲器。有两个带夹持器的吊舱可转移甲板位置内的板板:一个 96 通道固定体积移液头 (5-1100 μL) 和 8 通道可变体积探头 (1-1000 μL)。机器人平台使用软件进行控制。在使用机器人液体处理机之前,用户需要经过专业培训。本研究的重点是自动化手动 cPILOT 工作流,该工作流可以劳动密集型,用于在单个批次中处理 12 个样本。为了提高cPILOT方法11的吞吐量,我们将cPILOT协议转移到一个机器人液体处理程序中,以并行处理10多个样本。该自动化还允许在样品制备过程的各个步骤中对每个样品并行进行类似的反应,这需要训练有素的用户在手动 cPILOT 期间实现。该协议侧重于实现自动化液体处理装置以执行cPILOT。本研究描述了使用这种自动化系统的协议,并演示了其性能使用22丛”概念证明”分析小鼠肝同质质。
cPILOT 是一种增强的多路复用策略,可以在单个实验中分析多达 24 个样本。多路复用容量取决于可用的同位素和等值标记组合的数量。TMTpro7的引入,它能够在单个实验中标记16个样本,可以将cPILOT的极限推高到32丛。cPILOT 由多个移液步骤组成,需要广泛的护理和用户技能来执行样品制备。即使使用专家用户,手动错误也是不可避免的,这就促使使用机器人平台在 cPILOT 策略中处理样本。由于cPILOT使用肽的pH相关标记,因此需要为轻质和重二甲基化样品保持pH。轻度酸性基本pH值可导致N-termini和Lysine残留物的二甲基化。cPILOT 的一个优点是,它只需要半个等号标签,因为肽N-termini被二甲基组占据。这提供了更多的样品标签,成本的一半。处理较大的样本数要求试剂暴露时间与批次中第一个和最后一个样品的曝光时间相似。使用机器人液体处理设备,可以最好地实现可同时容纳多达 32 个样品的移液器分配器。
为了通过 cPILOT 处理多个样本,对手动工作流进行了修订,以纳入自动化。本研究中使用的机器人液体处理器有两个具有 96 通道和 8 通道移液能力的吊舱,其抓斗可将板放在可用的 28 个甲板位置。液体处理器与正压装置、轨道摇床和用于96井板中加热/冷却样品的装置集成在一起。正压装置有助于在清理过程中在SPE板中执行缓冲交换,而轨道摇床则有助于涡流/混合样品。机器人平台被编程为吸气和分配缓冲液和样品到96孔板,孵育,涡流样品,和转移板。具有不同粘度的液体(如乙酰胺和水)需要特定的移液注意事项,也可以编程到方法中。
从 BCA 的蛋白质定量到用等量标记(即 TMT)标记肽,CPILOT 工作流程在液体处理系统中执行。整个协议被扩展为使用96个深井板,可以容纳2 mL每井。缓冲液是在实验开始之前准备的,并添加到96井板中,以便进行平行样品处理。本研究将22种小鼠肝均质的工作流程复制添加到深井板中,并通过cPILOT协议进行。最后,将由22丛等量小鼠肝脏标记肽组成的单个样本注射到质谱仪中。报告器离子强度与样品中的肽丰度相对应,表明使用液体处理器处理的样品的简历比手动协议(未显示的数据)低。机器人平台还大大提高了样品加工的可重复性。在处理大量样品时,可重复性和鲁棒性是非常重要的因素。移液错误可能导致数据完全误读,因此机器人平台提供了低样本间变异。此外,使用机器人平台进行 cPILOT 缩短了准备样品的时间。例如,在开发自动化方法后,需要 2.5 小时来处理 22 个样本,而手动 cPILOT 需要 7.5 小时。我们的实验室正在进行实验,以进一步评估手动和自动 cPILOT 工作流的比较。根据我们实验室先前的报告,手动cPILOT中蛋白质报告器离子强度的CV%平均为20%,有些异常值超过此值12。
cPILOT 是肽级的化学衍生策略,可用于任何样品类型,如细胞、组织和体液。cPILOT 提供增强的样品多路复用,通过结合自动化,可以促进蛋白质组学中的高通量样品多路复用。这种吞吐量对于进一步推进疾病和生物理解和生物标志物发现是必要的。
The authors have nothing to disclose.
作者向RASR授予范德比尔特大学创业基金和NIH奖(R01GM117191)。
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
Tris | Biorad | 161-0716 | |
Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
Urea | Biorad | 161-0731 | |
Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |