Kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT), mevcut izobarik etiketlerle eş zamanlı olarak analiz edilebilen numune sayısını artırabilen gelişmiş bir numune çoklama stratejisidir. Robotik bir platformun dahil edilmesi deneysel iş bilgililiği, tekrarlanabilirliği ve nicel doğruluğu büyük ölçüde artırmıştır.
Biz yüksek iş akışı kantitatif proteomik iş akışı tanıttı, kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) tandem kitle etiketleri veya izobarik N, N-dimetil lösin izobaric etiketleri ile 22 veya 24 örnekleri çoklama yeteneğine sahip, sırasıyla, tek bir deneyde. Bu gelişmiş örnek çoklama önemli ölçüde kütle spektrometresi edinim sürelerini azaltır ve pahalı ticari izobarik reaktiflerin yarar artar. Ancak, stratejide numune işleme ve pipetleme adımlarının manuel süreci emek yoğun, zaman alıcı olabilir ve örnek kaybı ve nicel hata yada. Bu sınırlamalar otomasyon un dahil edilmesiyle aşılabilir. Burada manuel cPILOT protokolünü, paralel olarak büyük örnek numaraları (yani 96 örnek) hazırlayabilen otomatik bir sıvı işleme cihazına aktardık. Genel olarak otomasyon, cPILOT’un fizibilitesini ve tekrarlanabilirliğini artırır ve karşılaştırılabilir otomasyon cihazlarıyla diğer araştırmacılar tarafından geniş kullanıma olanak tanır.
Kütle spektrometresi (MS) tabanlı proteomik, hastalığa özgü biyobelirteçlerin belirlenmesinde, hastalığın ilerlemesini anlamada ve terapötik gelişime yol açan vazgeçilmez bir araştırma aracıdır. Bu kan serumu/ plazma, proksimal sıvılar ve dokular1gibi hastalıkla ilgili klinik örnekler bir dizi elde edilebilir,2. Proteomics biyomarker bulma ve doğrulama son zamanlarda örnek çoklama stratejileri nin gücü nedeniyle önemli dikkate kazanmıştır3,4. Örnek çoklama, tek bir MS enjeksiyonu içinde iki veya daha fazla örnek koşulun eşzamanlı olarak karşılaştırılmasını ve nicelemesini sağlayan bir tekniktir5,6. Numune çoklama, kimyasal, enzimatik veya metabolik etiketlerle birden fazla numuneden peptid veya proteinlerin barkodlanması ve tek bir MS veya MS/MS deneyindeki tüm örneklerden MS bilgisi alınması yla elde edilir. Mevcut izobarik etiketler ibarbarik etiketleme reaktifleri (iTRAQ), ticari tandem kitle etiketleri (TMT) ve evde sentezlenmiş izobarik N, N-dimethyl lösin (DiLeu) reaktifleri 16-pleks7 ve 21-pleks8yetenekleri vardır.
Kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) gelişmiş bir örnek çoklama teknolojisidir. cPILOT, peptit N-termininizin izotopik etiketlemesini hafif [−(CH3)2] ve ağır [−(13C2H)2] izotopları düşük pH’da ([2,5) birleştirir ve bu da lizin kalıntısını sonraki yüksek pH (8.5) izobarik etiketleme için TMT kullanarak kullanılabilir tutar, DiLeu veya iTRAQ etiketleme3,9,10,11,12,13,14. cPILOT stratejisinin çift etiketleme şeması, örnek bir peptid kullanılarak iki örnekle Ek Şekil 1’de gösterilmiştir. MS2 düzeyinde TMT tabanlı nicelemenin doğruluğu ve hassasiyeti, girişim etkisi15olarak nitelendirilen birlikte izole edilmiş ve birlikte parçalanmış iyonların kontamine olması nedeniyle tehlikeye atılabilir. Yanlış muhabir iyon oranlarındaki bu sınırlama tribrid Orbitrap kütle spektrometreleri yardımıyla aşılabilir. Örneğin, kütle spektrometresinde MS1 düzeyinde ki dimetil bir çiftteki tepeyi izole ederek, ışık veya ağır tepeyi doğrusal iyon tuzağındaki MS2 parçalanmasına maruz bırakarak ve daha sonra nicel bilgi elde etmek için HCD-MS3 için en yoğun MS2 parçasını maruz bırakarak girişim etkisi aşılabilir. Muhabir iyonları üretmek için mevcut olan lizin aminleri olmadan peptidseçme şansını artırmak için, y-1 parçasına dayalı seçici bir MS3 kazanımı da kullanılabilir ve cPILOT9ile ölçülebilen peptidlerin daha yüksek bir yüzdesi ile sonuçlanabilecek bir yaklaşımdır. Hafif ve ağır etiketlemenin birleşimi, numune çoklama yeteneklerini tek tek isobarik etiketlerle elde edilene 2 kat daha fazla dır. Biz son zamanlarda DiLeu reaktifler16ile tek bir deneyde en fazla 24 örnek birleştirmek için cPILOT kullandık. Ayrıca cPILOT oksidatif post-translational değişiklikler14 protein niterat17dahil çalışmak için kullanılmıştır , diğer küresel proteomlar9, ve bir Alzheimer hastalığı fare modelinde birden fazla doku örnekleri arasında uygulamaları göstermiştir11.
Sağlam numune hazırlama, bir cPILOT deneyinde kritik bir adımdır ve zaman alıcı, zahmetli ve kapsamlı olabilir. Gelişmiş numune çoklama kapsamlı pipetleme ve yüksek vasıflı laboratuvar personeli gerektirir ve deneyin tekrarlanabilirliğini büyük ölçüde etkileyebilen çeşitli faktörler vardır. Örneğin, numunelerin dikkatli bir şekilde işlenmesi, tüm numuneler için benzer reaksiyon sürelerini sağlamak ve hafif ve ağır dimetillenmiş numuneler için uygun tampon pH’ı korumak için gereklidir. Ayrıca, onlarca ila yüzlerce numunenin manuel olarak hazırlanması yüksek deneysel hataya neden olabilir. Bu nedenle, numune hazırlama değişkenliğini azaltmak, nicel doğruluğu artırmak ve deneysel iş akışını artırmak için otomatik bir cPILOT iş akışı geliştirdik. Otomasyon, iş akışının birçok yönünü tamamlayabilen robotik bir sıvı işleme cihazı kullanılarak sağlanır(Şekil 1). Protein niceleminden peptit etiketlemeye kadar numune hazırlama otomatik sıvı işleyicisi üzerinde gerçekleştirildi. Otomatik sıvı işleyici, katı faz lı ekstraksiyon (SPE) plakaları, orbital shaker ve ısıtma/soğutma cihazı arasındaki tampon değişimleri için pozitif basınç aygıtı (PPA) ile entegre edilmiştir. Robotik platform plakave tamponlar karşılamak için 28 güverte yerleri içerir. Güverte konumları içinde plakaları aktarmak için bir kavrayıcı ile iki pod vardır: 96 kanallı sabit hacimli pipetleme kafası (5-1100 μL) ve 8 kanal değişken hacim probları (1-1000 μL). Robotik platform bir yazılım kullanılarak kontrol edilir. Kullanıcının robotik sıvı işleyicisini kullanmadan önce profesyonel olarak eğitilmesi gerekir. Bu çalışma, 12’den fazla numunenin tek bir toplu iş halinde işlenmesi için emek yoğun olabilecek manuel cPILOT iş akışını otomatikleştirmek üzerinde odaklanmıştır. cPILOTyaklaşımı11’inişbzinin arttırılabilmesi için cPILOT protokolünü 10’dan fazla numuneyi paralel olarak işlemek üzere robotik bir sıvı işleyicisine aktardık. Otomasyon aynı zamanda her örnek için benzer reaksiyonlara, numune hazırlama sürecinin çeşitli adımları sırasında paralel olarak izin verir ve bu da yüksek eğitimli kullanıcıların manuel cPILOT sırasında bunu başarmasını gerektirir. Bu protokol, cPILOT’u gerçekleştirmek için otomatik sıvı taşıma cihazının uygulanmasına odaklanır. Bu çalışma, bu otomatik sistemi kullanma protokolünü açıklar ve fare karaciğerhomojenlerinin 22-pleksli “kavram kanıtı” analizi kullanılarak performansını göstermektedir.
cPILOT, tek bir deneyde en fazla 24 örneği analiz edebilen gelişmiş bir çoklama stratejisidir. Çoklama kapasitesi kullanılabilir izotopik ve izobarik etiketleme kombinasyonlarının sayısına bağlıdır. Tek bir deneyde 16 numuneyi etiketleme yeteneğine sahip olan TMTpro7’nintanıtımı, cPILOT’un sınırlarını 32-plex’e itebilir. cPILOT birden fazla pipetleme adımlarından oluşur ve numune hazırlama sı için kapsamlı bakım ve kullanıcı becerileri gerektirir. Uzman bir kullanıcıda bile, cPILOT stratejisinde örnekleri işlemek için robotik platformların kullanılmasını davet eden manuel hatalar kaçınılmazdır. cPILOT peptidlerin pH bağımlı etiketlemesini kullandığından, pH’nın hafif ve ağır dimetillenmiş numune ler için korunması gerekir. Hafif asidik-bazik pH hem N-termini hem de lizin artıklarının dimetilasyonuna neden olabilir. CPILOT bir avantajı peptit N-termini dimetil grupları ile işgal beri izobarik etiketlerin sadece yarısını gerektirir. Bu, daha fazla sayıda numunenin yarı maliyetle etiketlenmesine neden olur. Daha büyük örnek numaraların işlenmesi, reaktif maruziyet sürelerinin bir toplu işteki ilk ve son örnek için benzer olduğunu gerektirir. 32 numuneyi paralel olarak barındırabilen bir pipet dağıtıcısı, robotik sıvı taşıma cihazlarının kullanımı yla en iyi şekilde elde edilebilir.
CPILOT tarafından birden fazla numunenin işlenmesi için, manuel iş akışı otomasyonu da dahil etmek üzere değiştirildi. Bu çalışmada kullanılan robotik sıvı işleyici 96 kanallı ve 8 kanallı pipetleme yeteneklerine sahip iki bölmeye sahiptir ve plakaları mevcut 28 güverte konumuna yerleştirmek için bir kavrayıcıya sahiptir. Sıvı işleyici, pozitif basınç aparatı, orbital shaker ve 96 kuyu plakasındaki numuneleri ısıtmak/soğutmak için bir cihazla entegre edilmiştir. Pozitif basınç aparatı temizlik sırasında SPE plakalarında tampon değişiminin olmasına yardımcı olurken, orbital shaker numuneleri girdap/karıştırmaya yardımcı olur. Robotik platform, tampon ve numuneleri 96 kuyulu plakalara, kuluçkaya, girdap örneklerine ve transfer plakalarına aspire etmek ve dağıtmak için programlanmıştır. Asetonitril ve su gibi farklı viskozitelere sahip sıvılar, yönteme programlanabilecek özel pipetleme hususları gerektirir.
BCA tarafından protein niceleminden başlayarak peptidlerin isobarik etiketlerle (yani TMT) etiketlenmesine kadar cPILOT iş akışı sıvı işleyici sistemi üzerinde gerçekleştirildi. Protokolün tamamı, kuyu başına 2 mL tutabilen 96 derin kuyu plakası kullanılacak şekilde ölçeklendirildi. Arabellekler deney başlamadan önce hazırlandı ve paralel numune işleme izin vermek için 96 kuyu plakası eklendi. Bu çalışmada, fare karaciğerhomojenate 22 iş akışı kopyaları derin kuyu plakaları eklendi ve cPILOT protokolü ile alınmıştır. Son olarak, 22-plekse equimolar fare karaciğer etiketli peptidler oluşan tek bir örnek kütle spektrometre enjekte edildi. Örneklerdeki peptit bolluğuna karşılık gelen muhabir iyon yoğunlukları, sıvı işleyicisi ile işlenen numunelerin manuel protokolden daha düşük CV’lere sahip olduğunu göstermiştir(veriler gösterilmemiştir). Robotik platform aynı zamanda numune işlemenin tekrarlanabilirliğini de büyük ölçüde artırdı. Çok sayıda numune işlenirken tekrarlanabilirlik ve sağlamlık çok önemli faktörlerdir. Pipetleme hataları verilerin tamamen yanlış yorumlanmasına yol açabilir ve burada robotik platform düşük örnekler arası varyasyon sağladı. Ayrıca cPILOT için robot platformu kullanarak örnekleri hazırlamak için gerekli süreyi azalttı. Örneğin, otomatik yöntemi geliştirdikten sonra, 22 numunenin manuel cPILOT için 7,5 saate kıyasla işlenmesi için 2,5 saat gereklidir. El kitabı ve otomatik cPILOT iş akışlarının karşılaştırmalarını daha fazla değerlendirmek için laboratuvarımızda deneyler devam ediyor. Laboratuvarımızdan gelen önceki raporlara göre, manuel cPILOT protein muhabiri iyon yoğunluklarının CV% ortalama% 20 bu değeri12aşan bazı aykırı idi.
cPILOT, peptid düzeyinde hücreler, dokular ve vücut sıvıları gibi herhangi bir örneklem türü için kullanılabilen kimyasal bir türeçleştirme stratejisidir. cPILOT gelişmiş numune çoklama sunar ve otomasyonun dahil edilmesiyle proteomik lerde yüksek iş hacmi örnek çoklamayı kolaylaştırabilir. Bu iş, hastalık ve biyolojik anlayış ve biyomarker keşfini ilerletmek için gereklidir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar RASR için Vanderbilt Üniversitesi Start-up Fonları ve NIH ödülü (R01GM117191) kabul.
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
Tris | Biorad | 161-0716 | |
Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
Urea | Biorad | 161-0731 | |
Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |