תיוג איזוטופי משולב ותיוג איזובארי (cPILOT) היא אסטרטגיית מולטיפלקס מדגימה משופרת המסוגלת להגדיל את מספר הדגימות שניתן לנתח בו-זמנית עם תגיות איזובריות זמינות. התאגדות של פלטפורמה רובוטית הגדילה מאוד את התפוקה הניסיונית, הרבייה והדיוק הכמותי.
הצגנו זרימת עבודה פרוטאומיקה כמותית בתפוקה גבוהה, בשילוב תיוג איזוטופי מבשר ותיוג isobaric (cPILOT) מסוגל מולטיפלקס של עד 22 או 24 דגימות עם תגי מסה דו-דם או תגיות isobaric N,N-dimethyl לאוצין isobaric, בהתאמה, בניסוי יחיד. מדגם משופר זה multiplexing מפחית באופן משמעותי את זמני רכישת ספקטרומטריה מסה ומגביר את השירות של ריאגנטים isobaric מסחרי יקר. עם זאת, התהליך הידני של טיפול בדגימה וצעדי pipetting באסטרטגיה יכול להיות עבודה אינטנסיבית, זמן רב, ולהציג אובדן מדגם ושגיאה כמותית. ניתן להתגבר על מגבלות אלה באמצעות התאגדות של אוטומציה. כאן העבירנו את פרוטוקול CPILOT הידני למכשיר טיפול בנוזלים אוטומטי שיכול להכין מספרי דגימה גדולים (כלומר, 96 דגימות) במקביל. בסך הכל, אוטומציה מגבירה את הכדאיות והרבייה של מדד המחירים לצרכן ומאפשרת שימוש נרחב על ידי חוקרים אחרים עם התקני אוטומציה דומים.
ספקטרומטריית מסה (MS) פרוטאומיקה מבוססת הוא כלי מחקר חיוני בזיהוי סמנים ביולוגיים ספציפיים למחלה, הבנת התקדמות המחלה, ויצירת לידים לפיתוח טיפולי. ניתן להשיג זאת ממגוון של דגימות קליניות הקשורות למחלות כגון סרום דם/ פלזמה, נוזלים פרוקסימליים,ורקמות 1,2. גילוי ואימות של סמן ביולוגי Proteomics זכו לאחרונה לשיקול משמעותי בשל העוצמה של אסטרטגיות מרובותמדגם 3,4. מדגם multiplexing היא טכניקה המאפשרת השוואה בו-זמנית וכמות של שני תנאי מדגם או יותר בתוך הזרקת MSאחת 5,6. מדגם multiplexing מושגת על ידי פפטידים ברקוד או חלבונים מדגימות מרובות עם כימי, אנזימטי, או תגים מטבוליים וקבלת מידע MS מכל הדגימות בניסוי אחד MS או MS / MS. בין תגיות isobaric זמין הם ריאגנטים תיוג isobaric (iTRAQ), מסחרי תגים המוניים טנדם (TMT), ובבית מסונתז isobaric N,N-dimethyl leucine (DiLeu) ריאגנטים עם יכולות של עד 16-plex7 ו 21-plex8,בהתאמה.
תיוג איזוטופי משולב ותיוג איזוברי (cPILOT) הוא טכנולוגיית מולטיפלקס מדגימה משופרת. cPILOT משלב תיוג איזוטופי של פפטיד N-termini עם אור [-(CH3)2] וכבד [(13 C2H3)2]איזוטופים ב pH נמוך (∼2.5), אשר שומר על שאריות לינזין זמין עבור pH גבוה עוקבות (8.5) תיוג איזוברי באמצעות TMT, דילאו, או תיוג iTRAQ3,9,10,11,12,13,14. ערכת התיוג הכפולה של אסטרטגיית cPILOT מתוארת בדמות משלימה 1 עם שתי דוגמאות באמצעות פפטיד לדוגמה. הדיוק והדיוק של הכימות מבוסס TMT ברמת MS2 יכול להיות בסכנה בשל הנוכחות של מזהמים יונים מבודדים ומפוצלים co-fragmented בשם אפקטההפרעה 15. מגבלה זו ביחסי יון עיתונאי לא מדויק ניתן להתגבר בעזרת ספקטרומטרים מסה Orbitrap טריברי. לדוגמה, ניתן להתגבר על אפקט ההפרעה על-ידי בידוד שיאבזוג dimethylated ברמת MS 1 בספקטרומטר המסה, עצם הפסגה הקלה אוהכבדה לפיצול MS 2 במלכודת היונים הליניארית ולאחר מכן עצם שבר MS2 האינטנסיבי ביותר עבור HCD-MS3 כדי להשיג מידע כמותי. על מנת להגדיל את הסיכויים לבחור את הפפטידים ללא ליסין אמין זמין ליצירת יונים עיתונאיים, רכישת MS3 סלקטיבית המבוססת על שבר y-1 גם ניתן להשתמש והיא גישה אשר יכול לגרום אחוז גבוה יותר של פפטידים הניתנים לכימות עם cPILOT9. השילוב של תיוג קל וכבד מגדיל את יכולות ההטיה לדוגמה על-ידי פקטור של פי 2 לזה שהושג עם תגיות isobaric בודדות. לאחרונה השתמשנו cPILOT לשלב עד 24 דגימות בניסוי יחיד עם Reagents DiLeu16. בנוסף, נעשה שימוש ב-CPILOT כדי ללמוד שינויים חמצוניים לאחרתרגום 14, כולל חנקתחלבון 17, פרוטאומיםגלובליים אחרים 9, והדגימה יישומים על פני דגימות רקמות מרובות במודל עכבר מחלתאלצהיימר 11.
הכנת מדגם איתנה היא צעד קריטי בניסוי של CPILOT והיא יכולה להיות גוזלת זמן, מייגעת ונרחבת. מדגם משופר מולטיפלקסינג דורש צנרת נרחבת ואנשי מעבדה מיומנים, ויש מספר גורמים שיכולים להשפיע במידה רבה על יכולת הרבייה של הניסוי. לדוגמה, יש צורך בטיפול זהיר בדגימות כדי להבטיח זמני תגובה דומים עבור כל הדגימות ולשמור על pH של מאגר מתאים לדגימות דימתילציה קלות וכבדות. יתר על כן, הכנה ידנית של עשרות עד מאות דגימות יכולה לגרום לשגיאה ניסיונית גבוהה. לכן, כדי להפחית את השתנות הכנת המדגם, לשפר את הדיוק הכמותי ולהגדיל את התפוקה הניסיונית, פיתחנו זרימת עבודה אוטומטית של cPILOT. אוטומציה מושגת באמצעות התקן רובוטי לטיפול בנוזלים שיכול להשלים היבטים רבים של זרימת העבודה (איור 1). הכנה לדוגמה מכמת חלבונים לתיוג פפטיד בוצעה על מטפל נוזלי אוטומטי. המטפל הנוזלי האוטומטי משולב עם מערכת לחץ חיובית (PPA) לחילופי חוצץ בין לוחות החילוץ (SPE) של שלב מוצק, שייקר מסלולי והתקן חימום/קירור. הפלטפורמה הרובוטית מכילה 28 מיקומי סיפון כדי להכיל לוחות ומאגרים. ישנם שני תרמילים עם תופסן להעביר את הצלחות בתוך מיקומי הסיפון: ראש pipetting נפח קבוע 96 ערוצים (5-1100 μL) ו 8 ערוצים נפח משתנה בדיקות (1-1000 μL). הפלטפורמה הרובוטית נשלטת באמצעות תוכנה. המשתמש צריך להיות מאומן באופן מקצועי לפני השימוש המטפל נוזלי רובוטי. המחקר הנוכחי מתמקד באוטומציה של זרימת העבודה הידנית של CPILOT, שיכולה להיות עבודה אינטנסיבית לעיבוד יותר מ-12 דגימות באצווה אחת. על מנת להגדיל את התפוקה של גישת CPILOT11, העברתנו את פרוטוקול CPILOT למטפל נוזלי רובוטי כדי לעבד יותר מ-10 דגימות במקביל. האוטומציה גם מאפשרת תגובות דומות עבור כל מדגם במקביל במהלך שלבים שונים של תהליך הכנת המדגם, אשר דרש ממשתמשים מיומנים להשיג במהלך CPILOT ידני. פרוטוקול זה מתמקד בהטמעת התקן הטיפול הנוזלי האוטומטי לביצוע CPILOT. המחקר הנוכחי מתאר את הפרוטוקול לשימוש במערכת אוטומטית זו ומדגים את ביצועיו באמצעות ניתוח 22-plex “הוכחת הרעיון” של הומוגניאטים כבד העכבר.
cPILOT היא אסטרטגיית מוליפלקס משופרת שיכולה לנתח עד 24 דגימות בניסוי יחיד. קיבולת ההטיה תלויה במספר שילובי התיוגים באיזוטופיים ואיזובאריים הזמינים. הקדמה של TMTpro7, אשר מסוגל תיוג 16 דגימות בניסוי יחיד, יכול לדחוף את הגבולות של CPILOT ל 32-plex. CPILOT מורכבת ממספר שלבי צנרת ודורשת טיפול נרחב וכישורי משתמש לביצוע הכנה לדוגמה. גם עם משתמש מומחה, שגיאות ידניות הן בלתי נמנעות, אשר מזמינה את השימוש בפלטפורמות רובוטיות כדי לעבד דגימות באסטרטגיית cPILOT. מכיוון ש-CPILOT משתמש בתיוג תלוי pH של הפפטידים, יש לשמור על ה-pH עבור האור ואת סט הדגימות הכבדות. חומציות בסיסית במתינות pH יכול לגרום dimethylation של שני משקעים N-termini ו לינזין. היתרון של cPILOT הוא שזה דורש רק מחצית תגי isobaric מאז פפטיד N-termini עסוקים עם קבוצות דימתיל. זה מאפשר מספר גדול יותר של דגימות להיות מתויג בחצי העלות. טיפול במספרים לדוגמה גדולים יותר מחייב שזמן החשיפה של Reagent יהיה דומה לדוגמה הראשונה והאחרון באצווה. מתקן פיפטה שיכול להכיל עד 32 דגימות במקביל ניתן להשיג בצורה הטובה ביותר עם השימוש במכשירי טיפול בנוזל רובוטי.
על מנת לעבד דגימות מרובות על ידי cPILOT, זרימת העבודה הידנית תוקנה כדי לשלב אוטומציה. המטפל הנוזלי הרובוטי המשמש במחקר זה יש שני תרמילים עם יכולות pipetting 96-ערוצים ו 8 ערוצים, עם תופס למקם את הצלחות 28 מיקומי הסיפון הזמינים. המטפל הנוזלי משולב עם מערכת לחץ חיובית, שייקר מסלול, והתקן לדגימות חום/צינון בצלחת 96 באר. אפליקציית הלחץ החיובי מסייעת בביצוע חילופי חיץ בצלחות SPE במהלך הניקוי, בעוד שמנער המסלול מסייע למערבולת/לערבב את הדגימות. הפלטפורמה הרובוטית תוכנתה לשאוף ולחלק מאגרים ודגימות ל-96 לוחות, דגירה, דגימות מערבולת ולוחיות העברה. נוזלים עם צמיגות שונות, כגון acetonitrile ומים, דורשים שיקולי pipetting ספציפיים שניתן גם לתכנת לתוך השיטה.
זרימת העבודה של CPILOT, החל מכמת חלבון על ידי BCA ועד לתיוג הפפטידים עם תגיות איזובריות (כלומר, TMT), בוצעה במערכת המטפל הנוזלי. הפרוטוקול המלא היה קנה מידה להשתמש 96 צלחות באר עמוק שיכול להכיל 2 מ”ל לכל באר. המאגרים הוכנו לפני תחילת הניסוי והוספו לצלחת 96 באר כדי לאפשר עיבוד מדגם מקבילי. במחקר הנוכחי, 22 שכפולים של זרימת עבודה של הומוגנאט כבד העכבר נוספו צלחות באר עמוקה ונלקחו דרך פרוטוקול cPILOT. לבסוף, דגימה אחת המורכבת כבד עכבר שיווי משקל 22-plex מתויג פפטידים הוזרק ספקטרומטר המסה. עוצמת היונים העיתונאית המתאימה לשפע פפטיד בדגימות הוכיחה כי דגימות המעובדות עם המטפל הנוזלי יש CVs נמוך יותר מאשר הפרוטוקול הידני(נתונים לא מוצגים). הפלטפורמה הרובוטית גם שיפרה מאוד את יכולת הרבייה של עיבוד לדוגמה. שכפול וחוסן הם גורמים חשובים מאוד בעת עיבוד מספר גדול של דגימות. שגיאות Pipetting יכול להוביל לפרשנות שגויה מלאה של הנתונים וכאן הפלטפורמה הרובוטית סיפקה וריאציה בין-מדגם נמוך. כמו כן, השימוש בפלטפורמה הרובוטית ל-CPILOT הפחית את הזמן הנדרש להכנת דגימות. לדוגמה, לאחר פיתוח השיטה האוטומטית, נדרשו 2.5 שעות כדי לעבד 22 דגימות בהשוואה ל-7.5 שעות עבור CPILOT ידני. ניסויים הם מתמשכים במעבדה שלנו כדי להעריך עוד יותר השוואות של זרימות עבודה ידניות ואוטומטיות של CPILOT. בהתבסס על דיווחים קודמים מהמעבדה שלנו, CV%’s של עוצמת יון כתב חלבון בcPILOT ידני היו בממוצע 20% עם כמה חריגים עולה עלערך זה 12.
cPILOT היא אסטרטגיית נגזרות כימית ברמת הפפטיד, שניתן להשתמש בה עבור כל סוג מדגם כגון תאים, רקמות ונוזלי גוף. cPILOT מציעה מולטיפלקס מדגם משופר ועם שילוב של אוטומציה יכול להקל על מולטיפלקס מדגם בתפוקה גבוהה פרוטאומיקה. תפוקה זו נחוצה כדי לקדם עוד יותר מחלות והבנה ביולוגית וגילוי סמן ביולוגי.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מכירים בקרנות סטארט-אפ של אוניברסיטת ונדרבילט ובפרס NIH (R01GM117191) ל-RASR.
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
Tris | Biorad | 161-0716 | |
Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
Urea | Biorad | 161-0731 | |
Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |