الجمع بين وضع العلامات النظائرية السلائف وseobaric وضع العلامات (cPILOT) هو نموذج معزز استراتيجية تعدد قادرة على زيادة عدد العينات التي يمكن تحليلها في وقت واحد مع العلامات isobaric المتاحة. وقد أدى دمج منصة الروبوتية إلى زيادة كبيرة في الإنتاجية التجريبية، وقابلية التكاثر، والدقة الكمية.
لقد قدمنا عالية الإنتاجية الكمية proteomics سير العمل ، والجمع بين السلائف النظائر النظائرية ووضع علامات isobaric (cPILOT) قادرة على تعدد ما يصل إلى 22 أو 24 عينات مع علامات كتلة جنبا إلى جنب أو isobaric N ، N – dimethyl ليوتريك العلامات isobaric ، على التوالي ، في تجربة واحدة. هذه العينة المعززة multixing يقلل إلى حد كبير من حجم الاكتساب الطيفي الشامل ويزيد من فائدة الكواشف التجارية باهظة الثمن. ومع ذلك، يمكن أن تكون العملية اليدوية لمعالجة العينات وخطوات الأنابيب في الاستراتيجية كثيفة العمالة، تستغرق وقتاً طويلاً، وتُدخل فقدان العينة والخطأ الكمي. ويمكن التغلب على هذه القيود من خلال إدراج الأتمتة. هنا نقلنا بروتوكول cPILOT اليدوي إلى جهاز معالجة سائل آلي يمكنه إعداد أرقام عينة كبيرة (أي 96 عينة) بالتوازي. بشكل عام ، تزيد الأتمتة من جدوى و قابلية إنتاج cPILOT وتسمح بالاستخدام الواسع من قبل باحثين آخرين مع أجهزة أتمتة مماثلة.
إن البروتيومات التي تعتمد على قياس الطيف الكتلي (MS) هو أداة بحثية لا غنى عنها في تحديد المؤشرات الحيوية الخاصة بأمراض معينة، وفهم تطور المرض، وخلق خيوط للتنمية العلاجية. ويمكن تحقيق ذلك من مجموعة من العينات السريرية المرتبطة بالأمراض مثل مصل الدم / البلازما ، والسوائل القريبة ، والأنسجة1،2. وقد اكتسبت مؤخرا اكتشاف العلامات الحيوية للبروتيوميات والتحقق من أهمية نظرا كبيرا نظرا لقوة استراتيجيات تعدد العينات3،4. تعدد الأساليب هو تقنية تمكن من المقارنة في وقت واحد وتكميم اثنين أو أكثر من حالات العينة داخل حقن MS واحد5،6. يتم تحقيق تعدد العينات عن طريق التكويد الببتيدات أو البروتينات من عينات متعددة مع العلامات الكيميائية أو الأنزيمية أو الأيضية والحصول على معلومات التصلب المتعدد من جميع العينات في تجربة MS /MS/MS واحدة. من بين العلامات isobaric المتاحة هي الكواشف الاليوبات (iTRAQ) ، والعلامات كتلة جنبا إلى جنب التجارية (TMT) ، وفي المنزل توليفها isobaric N ، N – dimethyl leucine (DiLeu) الكواشف مع قدرات تصل إلى 16 – plex7 و 21 – plex8، على التوالي.
السلائف الملصقات النظائرية ووضع علامات الايسوباريك (cPILOT) هو نموذج المحسنة تكنولوجيا تعدد. يجمع cPILOT بين وضع العلامات النظيرية للببتيد N-termini مع الضوء [−(CH3)2] والثقيلة [−(13C2H3)2] نظائر في درجة حَوية منخفضة (∼2.5)، والتي تحافظ على بقايا الليسين المتاحة للعلامة الهيدروجينية العالية اللاحقة (8.5) الوئيب باستخدام TMT، DiLeu، أو iTRAQ وضع العلامات3،9،10،11،12،13،14. ويصور مخطط وضع العلامات المزدوجة لاستراتيجية cPILOT في الشكل التكميلي 1 مع عينتين باستخدام الببتيد كمثال. يمكن أن تكون دقة ودقة القياس الكمي TMT على مستوى MS2 عرضة للخطر بسبب وجود أيونات مُنْعزلة ومُتَقَدَّدة مُنْثَلِية تُـعَدُّ تأثير التداخل15. ويمكن التغلب على هذا القيد في نسب أيونات المراسل غير الدقيقة بمساعدة مطياف الكتلة ثلاثية الزفير أوربيراب. على سبيل المثال، يمكن التغلب على تأثير التداخل عن طريق عزل الذروة في زوج من ثنائي الديمثيلات عند مستوى MS1 في مطياف الكتلة، مع إخضاع الذروة الخفيفة أو الثقيلة لتجزئة MS2 في فخ أيون الخطي ثم إخضاع الجزء MS2 الأكثر كثافة للحصول على معلومات كمية. من أجل زيادة فرص اختيار الببتيدات دون أمينات ليسين المتاحة لتوليد الأيونات مراسل، واقتناء انتقائي MS3 على أساس y-1 جزء يمكن أيضا أن تستخدم وهو النهج الذي يمكن أن يؤدي إلى نسبة أعلى من الببتيدات قابلة للقياس الكمي مع cPILOT9. مزيج من الضوء والثقيلة وضع العلامات يزيد من قدرات تعدد العينات من قبل عامل من 2x إلى أن يتحقق مع العلامات isobaric الفردية. لقد استخدمنا مؤخرا cPILOT للجمع بين ما يصل إلى 24 عينات في تجربة واحدة مع الكواشف DiLeu16. بالإضافة إلى ذلك وقد استخدمت cPILOT لدراسة الأكسدة بعد التعديلات الانتقالية14 بما في ذلك nitration البروتين17, proteomes العالمية الأخرى9, وقد أظهرت تطبيقات عبر عينات أنسجة متعددة في نموذج فأر مرض الزهايمر11.
إعداد العينة القوية هي خطوة حاسمة في تجربة cPILOT ويمكن أن تستغرق وقتًا طويلاً وشاقاً وواسع النطاق. يتطلب تعدد العيّنات المُحسّن أن يكون مُعدّلًا واسع النطاق من العاملين في المختبرات ذوي المهارات العالية، وهناك العديد من العوامل التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على قابلية إعادة إنتاج التجربة. على سبيل المثال، من الضروري التعامل بعناية مع العينات لضمان أوقات رد فعل مماثلة لجميع العينات وللحفاظ على درجة الH الاحتياطية المناسبة للعينات الخفيفة والثقيلة الباهتة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي إعداد عشرات إلى مئات العينات يدوياً إلى حدوث خطأ تجريبي مرتفع. ولذلك ، للحد من إعداد عينة من التباين ، وتحسين الدقة الكمية ، وزيادة الإنتاجية التجريبية ، وضعنا سير العمل cPILOT الآلي. يتحقق الأتمتة باستخدام جهاز معالجة سائلة آلية يمكن أن تكمل العديد من جوانب سير العمل (الشكل 1). تم إعداد العينة من القياس الكمي للبروتين إلى وضع العلامات الببتيد على معالج سائل آلي. يتم دمج معالج السائل الآلي مع جهاز الضغط الإيجابي (PPA) لتبادل العازلة بين الطور الصلب استخراج لوحات (SPE)، شاكر المدارية، وجهاز التدفئة / التبريد. تحتوي المنصة الروبوتية على 28 موقعًا للتخزين لاستيعاب اللوحات والمخازن المؤقتة. هناك نوعان من القرون مع القابض لنقل لوحات داخل مواقع سطح السفينة: 96 قناة رئيس الأنابيب ذات حجم ثابت (5-1100 ميكرولتر) و 8 مسابير حجم متغير قناة (1-1000 μL). يتم التحكم في النظام الأساسي الروبوتي باستخدام برنامج. يحتاج المستخدم إلى تدريب مهني قبل استخدام معالج السائل الروبوتي. تركز هذه الدراسة على أتمتة سير العمل اليدوي cPILOT ، والذي يمكن أن يكون كثيف العمالة لمعالجة أكثر من 12 عينة في دفعة واحدة. من أجل زيادة إنتاجية نهج cPILOT11، قمنا بنقل بروتوكول cPILOT إلى معالج سائل روبوتي لمعالجة أكثر من 10 عينات بالتوازي. كما تسمح الأتمتة بتفاعلات مماثلة لكل عينة بالتوازي أثناء خطوات مختلفة من عملية إعداد العينة ، والتي تتطلب مستخدمين مدربين تدريباً عالياً لتحقيقها أثناء CPILOT اليدوي. ويركز هذا البروتوكول على تنفيذ جهاز معالجة السوائل الآلي لتنفيذ cPILOT. وتصف هذه الدراسة بروتوكول استخدام هذا النظام الآلي وتوضح أدائه باستخدام تحليل “إثبات المفهوم” من نوع 22-plex لتجانسات كبد الماوس.
cPILOT هي استراتيجية متعددة متعددة المحسنة التي يمكن أن تحليل ما يصل إلى 24 عينات في تجربة واحدة. تعتمد القدرة المتعددة على عدد مجموعات العلامات النظائرية وال Isobaric المتاحة. إدخال TMTpro7، التي هي قادرة على وضع علامات 16 عينات في تجربة واحدة ، يمكن أن تدفع حدود cPILOT إلى 32-plex. يتكون cPILOT من خطوات متعددة من الأنابيب ويتطلب رعاية واسعة ومهارات المستخدم لأداء إعداد العينة. حتى مع وجود مستخدم خبير ، فإن الأخطاء اليدوية أمر لا مفر منه ، مما يدعو إلى استخدام الأنظمة الأساسية الروبوتية لمعالجة العينات في استراتيجية cPILOT. منذ CPILOT يستخدم علامات pH تعتمد على الببتيدات، يجب الحفاظ على مادة PH للضوء ومجموعة من العينات dimethylated الثقيلة. يمكن أن يؤدي الأسي الحمضية الخفيفة إلى تينيثيليشن لكل من بقايا N-termini والليسين. ميزة من cPILOT هو أنه يتطلب سوى نصف علامات isobaric منذ الببتيد N-termini مشغولة مع مجموعات ثنائي الفينيل. وهذا يتيح لعدد أكبر من العينات أن تحمل علامات نصف التكلفة. يتطلب التعامل مع أعداد العينات الأكبر أن تكون أوقات التعرض للكاشف متشابهة للعينة الأولى والأخيرة في دفعة. يمكن الحصول على موزع ماصة يمكن أن تستوعب ما يصل إلى 32 عينة بالتوازي مع استخدام أجهزة معالجة السائل الروبوتية.
من أجل معالجة عينات متعددة من قبل cPILOT ، تم تعديل سير العمل اليدوي لدمج التشغيل الآلي. معالج السائل الروبوتية المستخدمة في هذه الدراسة اثنين من القرون مع 96 قناة و 8 قنوات الأنابيب القدرات، مع القابض لوضع لوحات في المواقع المتاحة سطح السفينة 28. يتم دمج معالج السائل مع جهاز الضغط الإيجابي، شاكر المدارية، وجهاز لتسخين / تبريد العينات في لوحة 96 جيدا. ويساعد جهاز الضغط الإيجابي في إجراء عمليات التبادل العازلة في لوحات SPE أثناء التنظيف، بينما يساعد الشاكر المداري على الدوامة/خلط العينات. تمت برمجة المنصة الروبوتية لتسفط وصرف المخازن المؤقتة والعينات إلى 96 بئرًا، واحتضان، وعينات دوامة، ولوحات نقل. السوائل ذات اللزوجة المختلفة، مثل الأسيتونيتريل والماء، تتطلب اعتبارات محددة الأنابيب التي يمكن أيضا أن تكون مبرمجة في الطريقة.
وقد تم تنفيذ سير عمل cPILOT ، بدءا من القياس الكمي للبروتين من قبل BCA إلى وضع العلامات الببتيدات مع علامات الايسوباريك (أي TMT) على نظام معالج السائل. تم تحجيم البروتوكول الكامل لاستخدام 96 لوحات بئر عميق يمكن أن تعقد 2 مل في البئر. وقد أعدت المخازن المؤقتة قبل بدء التجربة وأضيفت إلى لوحة البئر 96 بحيث تسمح بمعالجة العينات المتوازية. في هذه الدراسة، 22 تكرار سير العمل من التجانس الكبد الماوس تمت إضافتها إلى لوحات البئر العميق واتخذت من خلال بروتوكول cPILOT. وأخيرا، تم حقن عينة واحدة تتكون من الكبد 22-plex ماوس ثنائي الببتيدات الموسومة في مطياف الكتلة. أظهرت كثافة أيونات المراسل المقابلة لوفرات الببتيد في العينات أن العينات المعالجة مع معالج السائل لديها السير الذاتية أقل من البروتوكول اليدوي(البيانات غير مبينة). كما حسنت المنصة الروبوتية إلى حد كبير إمكانية إعادة إنتاج معالجة العينات. إن قابلية التكاثر والمتانة عاملان هامان للغاية أثناء معالجة أعداد كبيرة من العينات. يمكن أن تؤدي أخطاء الأنابيب إلى تفسير خاطئ كامل للبيانات وهنا وفرت منصة الروبوتية تباينًا منخفضًا بين العينات. كما أن استخدام النظام الأساسي الروبوتي لـ cPILOT قلل من الوقت اللازم لإعداد العينات. على سبيل المثال، بعد تطوير الطريقة الآلية، تطلب الأمر 2.5 ساعة لمعالجة 22 عينة مقارنة بـ 7.5 ساعة لـ cPILOT اليدوي. التجارب مستمرة في مختبرنا لإجراء مزيد من التقييم مقارنات سير العمل اليدوي والآلي cPILOT. استنادا إلى التقارير السابقة من مختبرنا، والسيرة الذاتية٪، من البروتين مراسل كثافة الأيونات في cPILOT اليدوي كانت في المتوسط 20٪ مع بعض القيم المتطرفة تتجاوز هذه القيمة12.
cPILOT هي استراتيجية اشتقاق كيميائية على مستوى الببتيد، يمكن استخدامها لأي نوع من العينات مثل الخلايا والأنسجة وسوائل الجسم. cPILOT يقدم متعددة العينة المحسنة ومع دمج الأتمتة يمكن أن يسهل multixing عينة عالية الإنتاجية في proteomics. هذا الإنتاج ضروري للمضي قدما في المرض والفهم البيولوجي واكتشاف العلامات البيولوجية.
The authors have nothing to disclose.
يعترف المؤلفان بأموال بدء العمل في جامعة فاندربيلت وجائزة المعاهد القومية للصحة (R01GM117191) لـ RASR.
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
Tris | Biorad | 161-0716 | |
Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
Urea | Biorad | 161-0731 | |
Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |