В этой статье описывается изоляция и культивирование эмбриональных крыс симпатической нейронов от высшего ганглиев шейки матки. Он также предоставляет подробные протоколы для иммуноцитохимического окрашивания и для подготовки нейрональных экстрактов для масс-спектрометрического анализа.
Симпатические нейроны из эмбриональной крысы выше цервикальных ганглиев (SCG) были использованы в качестве модели системы in vitro для периферических нейронов для изучения аксонального роста, аксонального оборота, синаптогенеза, дендритного роста, дендритной пластичности и нервно-целевого взаимодействия в системах совместной культуры. Этот протокол описывает изоляцию и диссоциацию нейронов от высших ганглиев шейки матки эмбрионов крысы E21, а затем подготовку и поддержание чистых нейронных культур в сыворотке свободной среде. Так как нейроны не придерживаются пластика без покрытия, нейроны будут культурированы либо на 12 мм стеклянных крышки или 6-хорошо пластин, покрытых поли-D-лизин. После лечения антимитотическим агентом (Ara-C, цитозин-D-арабинофуранозид), этот протокол генерирует здоровые нейронные культуры с менее чем 5% не-нейрональных клеток, которые могут поддерживаться в течение месяца в пробирке. Хотя эмбриональные нейроны SCG крысы являются многополярные с 5-8 дендритов в виво; в условиях, свободных от сыворотки, эти нейроны распространяются только на один аксон в культуре и продолжают быть однополярной в течение всего периода культуры. Тем не менее, эти нейроны могут быть вызваны продлить дендритов в присутствии экстракта мембраны подвала, кости морфогенетических белков (BMPs), или 10% плода икроножной сыворотки. Эти однородные нейронные культуры могут быть использованы для иммуноцитохимического окрашивания и для биохимических исследований. В этой статье также описывается оптимизированный протокол для иммуноцитохимического окрашивания микротрубочек, связанных с белком-2 (MAP-2) в этих нейронах и для подготовки нейрональных экстрактов для масс-спектрометрии.
Симпатические нейроны, полученные из эмбриональных превосходных ганглиев шейки матки (SCG) широко используются в качестве основной системы нейронной культуры для изучения многих аспектов развития нейронов, включая зависимость фактора роста, нейронно-целевые взаимодействия, нейромедиатор сигнализации, аксональный рост, дендрит развития и пластичности, синаптогенез и сигнальныемеханизмы,лежащие в основе нервно-целевой / нейрон-глиивзаимодействий 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Несмотря на их небольшой размер (около 10000 нейронов / ганглиев), Есть три основные причины для развития и широкого использования этой системы культуры я) является первым ганглиев в симпатической цепи, они больше, и, следовательно, легче изолировать, чем остальные симпатическойганглиев 10; ii) в отличие от центральных нейронов, нейроны в SCG довольно однородны со всеми нейронами, получаемыми из нервного гребня, имеющие аналогичный размер, зависимость от фактора роста нерва и быть ни-adrenergic. Это делает их ценной моделью для морфологическихи геномных исследований 10,,11 и iii) эти нейроны могут поддерживаться в определенной среде, свободной от сыворотки, содержащей фактор роста нервовв течение месяца 10,12. Перинатальные нейроны SCG широко используются для изучения механизмов, лежащих в основе инициации и поддержания дендритов2. Это главным образом потому, что, хотя SCG нейроны имеют обширные дендритные беседки in vivo, они не расширяют дендритов в пробирке в отсутствиесыворотки,но могут быть вызваны расти дендриты в присутствии определенных факторов роста, таких как кости морфогенетических белков2,12,13.
В этой статье описывается протокол для изоляции и культивирования эмбриональных нейронов SCG крыс. За последние 50 лет, первичные нейронные культуры из SCG были в основном использованы для морфологических исследований с ограниченным числом исследований изучения крупномасштабных геномных или протеомных изменений. Это в основном связано с небольшим размером ткани, что приводит к изоляции низкого количества ДНК или белка, что затрудняет проведение геномного и протеомного анализа этих нейронов. Тем не менее, в последние годы повышенная чувствительность обнаружения позволила разработать методы для изучения генома, miRNome и протеома в нейронах SCG во время дендритного развития роста14,,15,,16,17. Эта статья также будет описывать метод морфологического анализа этих нейронов с использованием иммуноцитохимии и протокол для получения экстрактов нейронального белка для масс-спектрометрического анализа.
Эта статья описывает протоколы для культивирования симпатических нейронов от превосходных ганглиев шейки матки эмбриональных щенков крыс. Преимущества использования этой модели системы в том, что можно получить однородную популяцию нейронов, обеспечивающих аналогичную реакцию на ф…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Фондом развития факультета и грантом Летней исследовательской программы в Колледже Святой Марии в Калифорнии. Авторы также хотели бы поблагодарить д-ра Памелу Лейн (Pamela Lein) из Калифорнийского университета в Дэвисе и д-ра Энтони Иавароне (Anthony Iavarone) из Калифорнийского университета в Беркли за их советы в ходе разработки этих протоколов. Авторы также хотели бы поблагодарить Хейли Нельсон в Управлении коммуникаций колледжа в колледже Сент-Мэри в Калифорнии за ее помощь в производстве видео и редактирования.
2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
Glass coverlips – 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
Trifluoro acetic acid – Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |