מאמר זה מתאר את הבידוד וההתלות של נוירונים אוהדים של חולדה עוברית מגנגליה צוואר הרחם מעולה. הוא גם מספק פרוטוקולים מפורטים עבור כתמים חיסוניים והכנת תמציות עצביות לניתוח ספקטרומטרי מסה.
נוירונים סימפטיים מן החולדה העוברית מעולה ganglia צוואר הרחם (SCG) שימשו כמערכת מודל מבחנה עבור נוירונים היקפיים לחקור צמיחה סקסונית, סחר באקסונים, סינפטוגנזה, צמיחה דנדריטית, פלסטיות דנדריטית ואינטראקציות מטרה עצבית במערכות תרבות שותף. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והניתיקות של תאי העצב מהגרגליה צוואר הרחם מעולה של עוברי חולדה E21, ואחריו הכנה ותחזוקה של תרבויות עצביות טהורות במדיום ללא סרום. מאז נוירונים אינם לדבוק פלסטיק לא מצופה, נוירונים יהיה תרבותי על או 12 מ”מ כיסוי זכוכית או 6-well צלחות מצופה פולי-D-לינזין. לאחר טיפול עם סוכן אנטימיוטי (Ara-C, ציטוסין β-D-arabinofuranoside), פרוטוקול זה יוצר תרביות עצביות בריאות עם פחות מ 5% תאים שאינם נוירוניים, אשר ניתן לשמור במשך יותר מחודש במבחנה. למרות חולדה עוברית SCG נוירונים הם רב קוטבי עם 5-8 דנדריטים ב vivo; בתנאים ללא סרום, נוירונים אלה להרחיב רק axon אחד בתרבות ולהמשיך להיות חד קוטבי למשך כל התרבות. עם זאת, נוירונים אלה יכולים להיות מושרה להאריך דנדריטים בנוכחות תמצית קרום מרתף, חלבונים מורפוגנטיים עצם (BMPs), או 10% סרום עגל עוברי. תרבויות עצביות הומוגניות אלה יכולות לשמש להכתמה חיסונית ולחקרים ביוכימיים. מאמר זה מתאר גם פרוטוקול אופטימיזציה עבור כתמים חיסוניים עבור microtubule הקשורים חלבון-2 (MAP-2) בנוירונים אלה, להכנת תמציות עצביות לספקטרומטריה מסה.
נוירונים סימפטיים נגזר גנגליה צוואר הרחם מעולה עוברי (SCG) שימשו באופן נרחב כמערכת תרבות עצבית ראשית לחקר היבטים רבים של התפתחות עצבית כולל תלות גורם גדילה, אינטראקציות נוירון-יעד, נוירוטרנסמיטר איתות, צמיחה סקסוני, פיתוח דנדריט ו פלסטיות, סינפטוגנזה ומנגנוני איתות הבסיסית עצב-יעד / נוירון-glia אינטראקציות1,,2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,,9. למרות גודלם הקטן (כ-10000 נוירונים/גנגליה), ישנן שלוש סיבות עיקריות לפיתוח ולשימוש נרחב במערכת תרבות זו הם אני) להיות הגנגליה הראשונה בשרשרת הסימפטית, הם גדולים יותר, ולכן קל יותר לבודד, מאשר שאר הגנגליה הסימפטית10; ii) בניגוד לנוירונים המרכזיים, הנוירונים ב-SCG הם הומוגניים למדי עם כל הנוירונים הנגזרים מהציצה העצבית, בעל גודל דומה, תלות בגורם גדילה עצבי ולהיות נור-adrenergic. זה הופך אותם מודל יקר ערך עבור מחקרים מורפולוגיים וגנומיים10,11 ו- iii) נוירונים אלה יכולים להישמר במדיום מוגדר ללא סרום המכיל גורם גדילהעצבי במשך יותר מחודש 10,12. נוירונים SCG Perinatal שימשו בהרחבה לחקר המנגנונים הבסיסיים ייזום ותחזוקה של דנדריטים2. הסיבה לכך היא בעיקר, למרות נוירונים SCG יש arbor דנדריטי נרחב vivo, הם לא להרחיב דנדריטים במבחנה בהיעדר סרום, אבל יכול להיות מושרה לגדול דנדריטים בנוכחות גורמי גדילה מסוימים כגון חלבונים מורפוגנטעצם 2,,12,13.
מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לבידוד ולקולות נוירונים SCG חולדה עוברית. במהלך 50 השנים האחרונות, תרבויות עצביות עיקריות של SCG שימשו בעיקר מחקרים מורפולוגיים עם מספר מוגבל של מחקרים הבוחנים את השינויים הגנומיים או פרוטאומיים בקנה מידה גדול. זה בעיקר בשל גודל רקמה קטנה וכתוצאה מכך בידוד של כמויות נמוכות של DNA או חלבון, מה שמקשה לבצע ניתוחים גנומיים ופרוטונומיים על נוירונים אלה. עם זאת, בשנים האחרונות, רגישות גילוי מוגברת אפשרה פיתוח של שיטות לבחון את הגנום, miRNome ופרוטומה בנוירונים SCG במהלך פיתוח צמיחהדנדריטית 14,15,16,17. מאמר זה יתאר גם את השיטה לניתוח מורפולוגי של נוירונים אלה באמצעות אימונוציטוכימיה ופרוטוקול כדי להשיג תמציות חלבון עצבי לניתוח ספקטרומטרי מסה.
מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים לתפירת נוירונים סימפטיים מגנגליה צוואר הרחם מעולה של גורי חולדות עובריות. היתרונות של שימוש במערכת מודל זה הם כי ניתן להשיג אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים מתן תגובה דומה גורמי גדילה, ומאז דרישות גורם גדילה עבור נוירונים אלה כבר מאופיין היטב, ניתן לגדל נוירונים…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן לפיתוח הפקולטה ומענק תוכנית מחקר קיץ במכללת סנט מרי של קליפורניה. המחברים גם רוצים להודות ד”ר פמלה לין באוניברסיטת קליפורניה דייוויס וד”ר אנתוני Iavarone באוניברסיטת ברקלי Mass ספקטרומטריה מתקן על עצתם במהלך הפיתוח של פרוטוקולים אלה. המחברים גם רוצים להודות להיילי נלסון במשרד לתקשורת במכללה סנט מרי של קליפורניה על עזרתה בהפקת וידאו ועריכה.
2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
Glass coverlips – 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
Trifluoro acetic acid – Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |