Síntese enzimática de metabólitos Epoxidizados de ácidos docosahexaenóico, eicosapentaenóico e Aracidônico
Özet
Nós apresentamos um método útil para a síntese e a purificação enzimáticas em grande escala de enantiômeros e de regioisômeros específicos dos epóxidos do ácido araquidônico (AA), do ácido docosahexaenóico (DHA), e do ácido eicosapentaenóico (EPA) com o uso de um citocromo bacteriano Enzima P450 (BM3).
Abstract
Os metabólitos epoxidizados de vários ácidos graxos poli-insaturado (PUFAs), denominados ácidos graxos epóxi, têm uma ampla gama de papéis na fisiologia humana. Estes metabolitos são produzidos endogenamente pela classe de enzimas do citocromo P450. Por causa de seus efeitos biológicos diversos e potentes, há um interesse considerável em estudar estes metabolitos. Determinar as funções únicas destes metabolitos no corpo é uma tarefa difícil, como os ácidos graxos epóxi deve primeiro ser obtido em quantidades significativas e com alta pureza. A obtenção de compostos de fontes naturais é muitas vezes trabalhoso, e Hidrolina de epoxida solúvel (sEH) rapidamente hidrolisar os metabolitos. Por outro lado, a obtenção desses metabólitos por meio de reações químicas é muito ineficiente, devido à dificuldade de obtenção de regioisômeros puros e enantiômeros, baixos rendimentos e purificação extensa (e cara). Aqui, nós apresentamos uma síntese enzimática eficiente de 19 (s), 20 (r)-e 16 (s), 17 (r)-ácidos epoxydocosapentaenoic (edps) de DHA através do epoxidação com BM3, uma enzima CYP450 bacteriana isolada originalmente do bacilo megaterium (que é prontamente expresso em Escherichia coli). A caracterização e a determinação da pureza são realizadas com espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e espectrometria de massas (MS). Este procedimento ilustra os benefícios da síntese enzimática de metabolitos da epoxi de PUFA, e é aplicável à epoxidação de outros ácidos gordos, incluindo o ácido araquidônico (AA) e o ácido eicosapentaenóico (EPA) para produzir o epoxyeicosatrienoic análogo ácidos (Eets) e ácidos ver (EEQS), respectivamente.
Introduction
Como o interesse no papel que os ácidos gordos polyinsaturados (particularmente Omega-3 e Omega-6 ácidos gordos polyinsaturados) jogam na biologia humana cresceu nos últimos anos, os investigadores tomaram a observação da escala larga de benefícios atraentes que seus metabolitos Exposição. Em particular, os metabólitos de ácidos graxos epóxi produzidos pela classe de enzimas do citocromo P450 têm sido um grande ponto de foco. Por exemplo, muitos epoxídeos de PUFA, incluindo ácidos epoxyeicosatrienoic (Eets), ácidos ver (edps) e ácidos ver (EEQS), desempenham um papel crítico na regulação da pressão arterial e inflamação1,2 , 3. º , 4. º , 5. Curiosamente, os enantiômeros e regioisômeros específicos dos epoxídeos AA e EPA são conhecidos por terem efeitos variados sobre a vasoconstrição6,7. Enquanto os efeitos fisiológicos dos enantiômeros e regioisômeros de EETs e EEQs foram documentados, pouco se sabe sobre o efeito dos ácidos epoxydocosapentaenóicos análogos (EDPs) formados a partir de DHA. O uso generalizado do óleo de peixe8, que é rico em EPA e DHA, também despertava o interesse na AEPD9. Os benefícios destes suplementos são acreditados para ser em parte devido aos metabolitos a jusante DHA (16,17-EDP e 19,20-EDP sendo o mais abundante) porque in vivo níveis de EDPs coordenar muito bem com a quantidade de DHA na dieta10, o 11.
Estudar os mecanismos e alvos destes ácidos graxos epóxi por Metabolomics, biologia química, e outros métodos tem provado desafiador, em parte porque eles existem como misturas de Regio-e estéreo-isómeros, e um método de obtenção de quantidades puras do são necessários enantiômeros e regioisômeros. Os meios convencionais para sintetizar quimicamente estes compostos provaram ineficaz. O uso de peroxyacid como o ácido meta-chloroperoxybenzoic para o epoxidação tem muitas desvantagens, notàvel a falta do selectivity do epoxidação, que necessita a purificação cara e meticulosa de regioisômeros e de enantiomers individuais. A síntese total dos metabólitos de DHA e EPA é possível, mas também sofre de desvantagens que o tornam impraticável para a síntese em larga escala, como altos custos e baixos rendimentos12,13. A produção global eficiente pode ser conseguida com síntese enzimática, pois as reações enzimáticas são Regio-e estereosseletivas14. Estudos mostram que a epoxidação enzimática de AA e EPA (com BM3) é tanto regioseletiva e enantioseletiva15,16,17,18, mas este procedimento não foi testado com DHA, ou em um grande Escala. O objetivo geral de nosso método era escalar acima e aperfeiçoar esta epoxidação chemoenzimática para produzir ràpida quantidades significativas de ácidos gordos puros da cola Epoxy como seus enantiomers individuais. Usando o método apresentado aqui, os pesquisadores têm acesso a uma estratégia simples e rentável para a síntese de EDPs e outros metabólitos de epóxi PUFA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresentamos aqui um método operacionalmente simples e econômico para a preparação dos dois metabólitos epoxídicos mais abundantes de DHA-19, 20 e 16,17-EDP. Estes ácidos graxos epóxi podem ser preparados em altamente enantiopure (como seu S, R-isómeros) forma usando selvagem-tipo BM3 enzima. Vários pontos críticos que podem ser usados para solução de problemas, e a extensão do nosso método para a preparação de metabólitos epóxi enantiopure de AA e EPA, são descritos abaixo.
<p class="jov…Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é financiado por r00 ES024806 (institutos nacionais de saúde), DMS-1761320 (National Science Foundation) e fundos de arranque da Universidade Estadual de Michigan. Os autores desejam agradecer ao Dr. Jun Yang (Universidade da Califórnia em Davis) e Lalitha Karchalla (Michigan State University) para obter assistência com a otimização da reação enzimática, e Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass espectrometria e Metabolomics Facility) para obter assistência com a aquisição de dados da HRMS.
Materials
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
Referanslar
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