도코사헥사에노믹, 에이코사펜타에노믹, 아라키돈산의 에폭시화된 대사산물의 효소 합성
Özet
우리는 세균성 시토크롬을 사용하여 아라키돈산(AA), 도코사헥사에노산(DHA), 에이코사펜테노산(EPA)의 특정 상악제 및 레지오이좀의 대규모 효소 합성 및 정제에 유용한 방법을 제시합니다. P450 효소 (BM3).
Abstract
다양한 불포화 지방산 (PUFAs)의 에폭시화 대사 산물은 에폭시 지방산이라고 불리우며 인간 생리학에서 광범위한 역할을 합니다. 이 대사 산물은 효소의 시토 크롬 P450 클래스에 의해 내인성으로 생산됩니다. 그들의 다양 하 고 강력한 생물학적 효과 때문에, 이러한 대사 산물 공부에 상당한 관심이 있다. 에폭시 지방산이 먼저 상당한 양과 높은 순도로 얻어져야하기 때문에 신체에서 이러한 대사 산물의 독특한 역할을 결정하는 것은 어려운 작업입니다. 천연 공급원으로부터 화합물을 얻는 것은 종종 노동 집약적이며 수용성 에폭사이드 하이드로 라제 (sEH)는 대사 산물을 빠르게 가수 분해합니다. 다른 한편으로는, 화학 반응을 통해 이러한 대사 산물을 얻는 것은 매우 비효율적입니다, 순수한 regioisomers 및 상체 물질을 얻기의 어려움으로 인해, 낮은 수율, 광범위한 (고가의) 정제. 여기에서, 우리는 BM3를 가진 에폭시를통해 DHA에서 19(S),20(R)-및 16(S),17(R)-에폭시도코펜타에노산(EDPs)의 효율적인 효소 합성을 제시합니다, 원래 바실러스에서 분리된 세균 CYP450 효소 megaterium (즉, 쉽게 대장균에표현된다). 순도의 특성화 및 측정은 핵 자기 공명 분광법 (NMR), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 질량 분석법 (MS)으로 수행됩니다. 이 절차는 PUFA 에폭시 대사 산물의 효소 합성의 이점을 설명하고, 유사한 에폭시에이코사이코노레이노어를 생성하는 아라키돈산(AA) 및 에이코사펜타에노산(EPA)을 포함한 다른 지방산의 에폭시화에 적용가능하다. 산 (EETs) 및 에폭시에이코에테라에노산(EEQs).
Introduction
고도 불포화 지방산 (특히 오메가-3 및 오메가-6 불포화 지방산)이 인간 생물학에서 재생하는 역할에 대한 관심이 최근 몇 년 동안 증가함에 따라, 연구자들은 자신의 대사 산물이 매력적인 혜택의 넓은 범위의 주의를 촬영하고있다 전시. 특히, 효소의 시토크롬 P450 클래스에 의해 생성된 에폭시 지방산 대사산물은 큰 초점포인트가 되어 왔다. 예를 들어, 에폭시에코사트리노산(EETs), 에폭시도코사펜타에노산(EDPs) 및 에폭시코사테라에노산(EEQs)을 포함한 많은 PUFA 에폭산화물은 혈압 및 염증조절에 중요한 역할을 합니다 1,2 , 3개 , 4개 , 5. 흥미롭게도, AA 및 EPA 에폭사이드의 특정 상체및 레지오머는 혈관 수축에 다양한효과를 가지는 것으로 알려져 있다 6,7. EET및 EEQs의 상체및 레지오좀의 생리학적 효과는 문서화되었지만, DHA로부터 형성된 유사한 에폭시도코사펜타에노산(EDPs)의 효과에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. EPA와 DHA가 풍부한 피시 오일8의광범위한 사용은 EDP9에대한 관심을 불러 일으켰습니다. 이러한 보충제의 혜택은 부분적으로 다운스트림 DHA 대사 산물로 인해 것으로 추정된다 (16,17-EDP 와 19,20-EDP는 가장 풍부한 되는) EDP의 생체 내 수준은 다이어트에 DHA의 양과 아주 잘 조정하기 때문에10, 11.
대사체학, 화학 생물학 및 기타 방법에 의한 이러한 에폭시 지방산의 메커니즘과 표적을 연구하는 것은 레지오-및 스테레오 이성물질의 혼합물로 존재하기 때문에 부분적으로 도전적인 것으로 입증되었으며, 순수한 양의 지방을 얻는 방법 적분자 및 레지아이좀이 필요합니다. 화학적으로 이러한 화합물을 합성 하기 위한 전통적인 수단 효과가 입증 되었습니다. 에폭시화를 위한 메타-클로로페록시벤조산과 같은 페록시산의 사용은 많은 단점, 특히 개별 레지오이좀제와 상각체의 고가의 고된 정제를 필요로 하는 에폭시화 선택성의 부족이 있다. DHA 및 EPA 대사산물의 총 합성이 가능하지만, 또한 높은 비용과 낮은 수율12,13과같은 대규모 합성에 비실용적만드는 단점을 앓고 있다. 효소 반응이 레지오-및 스테레오셀렉티브(14)이기 때문에 효소합성으로 효율적인 전체 생산을 달성할 수 있다. 연구 결과에 따르면 AA와 EPA(BM3)의 효소 에피시형성은 재지오선택적 및 enantioselective15,16,17,18,그러나 이 절차는 DHA로 시험되지 않았거나 큰 규모. 우리의 방법의 전반적인 목표는 그들의 개별 enantiomers로 순수한 에폭시 지방산의 상당한 양을 급속하게 생성하기 위하여 이 화학 요법 에폭시를 확장하고 낙관하는 것이었습니다. 여기에 제시 된 방법을 사용하여, 연구원은 EDP 및 기타 PUFA 에폭시 대사 산물의 합성을위한 간단하고 비용 효율적인 전략에 액세스 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 DHA의 두 가지 가장 풍부한 에폭시 대사 산물을 준비하기위한 운영적으로 간단하고 비용 효율적인 방법을 제시 – 19,20 및 16,17-EDP. 이러한 에폭시 지방산은 야생형 BM3 효소를 사용하여 고도로 에난티오퓨어(S,R-이솜) 형태로 제조될 수 있다. 문제 해결에 사용될 수 있는 몇 가지 중요한 점과 AA 및 EPA의 enantiopure 에폭시 대사 산물을 준비하는 우리의 방법의 확장은 아래에 설명되어 있습니…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 R00 ES024806 (건강의 국가 학회), DMS-1761320 (국립 과학 재단) 및 미시간 주립 대학에서 시작 기금에 의해 지원됩니다. 저자는 준 양 박사 (데이비스 캘리포니아 대학)와 라리타 Karchalla (미시간 주립 대학) 효소 반응의 최적화에 대한 도움을 감사하고 자, 박사 토니 쉴밀러 (MSU 질량 분광및 Metabolomics 시설) HRMS 데이터 수집에 대한 지원을 제공합니다.
Materials
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
Referanslar
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