Síntesis enzimática de metabolitos epepoxiizados de ácidos docosahexaenoico, eicosapentaenoico y aracidonico
Özet
Presentamos un método útil para la síntesis enzimática a gran escala y la purificación de enantiómeros y regioiómeros específicos de epóxidos de ácido araquidónico (AA), ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido eicosapentaenoico (EPA) con el uso de un citocromo bacteriano (AH), ácido docosahexaenoico (DHA), y ácido eicosapentaenoico (EPA) con el uso de un citocromo bacteriano (AA), ácido docosahexaenoico (DHA), y ácido eicosapentaenoico (EPA) con el uso de un citocromo bacteriano Enzima P450 (BM3).
Abstract
Los metabolitos epepoxiizados de varios ácidos grasos poliinsaturados (PUF), llamados ácidos grasos epoxi, tienen una amplia gama de funciones en la fisiología humana. Estos metabolitos son producidos endógenamente por la clase de enzimas del citocromo P450. Debido a sus diversos y potentes efectos biológicos, hay un interés considerable en el estudio de estos metabolitos. Determinar las funciones únicas de estos metabolitos en el cuerpo es una tarea difícil, ya que los ácidos grasos epoxi primero deben obtenerse en cantidades significativas y con alta pureza. La obtención de compuestos de fuentes naturales es a menudo intensiva en mano de obra, y las hidrolasas de epóxido soluble (sEH) hidrolizan rápidamente los metabolitos. Por otro lado, la obtención de estos metabolitos a través de reacciones químicas es muy ineficiente, debido a la dificultad de obtener regioisomers y enantiómeros puros, bajos rendimientos y purificación extensa (y costosa). Aquí, presentamos una síntesis enzimática eficiente de 19(S),20(R)- y 16(S),17(R)-ácidos epoxidocosapentaenoicos (EDP) de DHA a través de epoxidación con BM3, una enzima bacteriana CYP450 aislada originalmente de Bacillus megaterium (que se expresa fácilmente en Escherichia coli). La caracterización y determinación de la pureza se realiza con espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y espectrometría de masas (MS). Este procedimiento ilustra los beneficios de la síntesis enzimática de metabolitos epoxi PUFA, y es aplicable a la epoxidación de otros ácidos grasos, incluyendo ácido araquidónico (AA) y ácido eicosapentaenoico (EPA) para producir el epoxieicosatrienoico análogo ácidos (EAT) y ácidos epoxiicosatetraenoicos (EEQ), respectivamente.
Introduction
Como el interés en el papel que juegan los ácidos grasos poliinsaturados (particularmente los ácidos grasos poliinsaturados omega-3 y omega-6) en la biología humana ha crecido en los últimos años, los investigadores han tomado nota de la amplia gama de beneficios atractivos que sus metabolitos Exhiben. En particular, los metabolitos de ácidos grasos epoxi producidos por la clase de enzimas del citocromo P450 han sido un gran punto de enfoque. Por ejemplo, muchos epóxidos de PUFA, incluidos los ácidos epoxiicosatrienoicos (EET), los ácidos epoxidocosapentaenoico (EDP) y los ácidos epoxiicosatetraenoicos (EEQ), desempeñan un papel crítico en la regulación de la presión arterial y la inflamación1,2 , 3 , 4 , 5. Curiosamente, los enantiómeros específicos y regioisomers de aA y EPóxidos EPA son conocidos por tener efectos variables sobre vasoconstricción6,7. Si bien se han documentado los efectos fisiológicos de los enantiómeros y regioisomemeros de los EET y los EEQ, poco se sabe sobre el efecto de los ácidos epoxicosapentaenoicos análogos (EDP) formados a partir de DHA. El uso generalizado del aceite de pescado8, que es rico tanto en EPA como en DHA, también ha despertado interés en los EDP9. Los beneficios de estos suplementos se cree que son en parte debido a los metabolitos DHA aguas abajo (16,17-EDP y 19,20-EDP siendo los más abundantes) porque los niveles in vivo de EDPs se coordinan muy bien con la cantidad de DHA en la dieta10, 11.
El estudio de los mecanismos y objetivos de estos ácidos grasos epoxi por metabolómica, biología química y otros métodos ha resultado desafiante, en parte porque existen como mezclas de isómeros regio y estéreo, y un método para obtener cantidades puras de la enantiómeros y regioisomers. Los medios convencionales para sintetizar químicamente estos compuestos han demostrado ser ineficaces. El uso de peroxyacids como el ácido meta-cloroperoxybenzoic para la epoxidación tiene muchos inconvenientes, en particular la falta de selectividad de la emiratoje, que requiere una purificación costosa y meticulosa de los regioiómeros y enantiómeros individuales. La síntesis total de los metabolitos DHA y EPA es posible, pero también sufre de inconvenientes que lo hacen poco práctico para la síntesis a gran escala como altos costos y bajos rendimientos12,13. La producción global eficiente se puede lograr con síntesis enzimática, ya que las reacciones enzimáticas son regio- y estereoselectiva14. Los estudios demuestran que la epoxidación enzimática de AA y EPA (con BM3) es a la vez regioselectiva y enantioselectiva15,16,17,18, pero este procedimiento no ha sido probado con DHA, o en un gran Escala. El objetivo general de nuestro método era escalar y optimizar esta epoxidación quimioenzimática para producir rápidamente cantidades significativas de ácidos grasos epoxi puros como sus enantiómeros individuales. Utilizando el método presentado aquí, los investigadores tienen acceso a una estrategia simple y rentable para la síntesis de EDPs y otros metabolitos epoxi PUFA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentamos aquí un método operativo simple y rentable para preparar los dos metabolitos epoxi más abundantes de DHA – 19,20 y 16,17-EDP. Estos ácidos grasos epoxi se pueden preparar en forma altamente enantiopure (como sus isómeros S,R)utilizando enzima BM3 de tipo salvaje. A continuación se describen varios puntos críticos que se pueden utilizar para la solución de problemas y la extensión de nuestro método para preparar metabolitos epoxi enantiopuros de AA y EPA.
…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo está financiado por R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) y fondos de startups de la Universidad Estatal de Michigan. Los autores desean agradecer al Dr. Jun Yang (Universidad de California en Davis) y la Lalitha Karchalla (Universidad Estatal de Michigan) por su ayuda con la optimización de la reacción enzimática, y al Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass Spectrometry and Metabolomics Facility) asistencia con la adquisición de datos HRMS.
Materials
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
Referanslar
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