Özet

Farelerde uyku/uyanıklık durumları Izleme sırasında nöral devrelerin optogenetik manipülasyon

Published: June 19, 2019
doi:

Özet

Burada, biz farelerde uyku/uyanıklık devletlerin izlenmesi sırasında nöronların belirli türlerinin optogenetik manipülasyon yöntemlerini açıklamak, bir örnek olarak stria terminalis yatak çekirdeği üzerinde son çalışma sunma.

Abstract

Son yıllarda, optogenetik yaygın nörooscientifik araştırma birçok alanda kullanılmıştır. Birçok durumda, bir opsin, kanal rodopsin 2 (ChR2) gibi, çeşitli CRE-sürücü fareler nöronal hücrelerin belirli bir tür bir virüs vektörü tarafından ifade edilir. Bu opgünahların aktivasyonu, lazer veya LED optik kablolar aracılığıyla teslim edilen ışık darbeleri uygulaması ile tetiklenir ve aktivasyon etkisi çok yüksek zaman çözünürlüğü ile görülür. Deneyler, farelerde davranışı veya başka bir fizyolojik sonucu izlerken nöronları akut uyarmak edebiliyoruz. Optogenetiği, farelerde uyku/uyanıklık devletlerinin düzenlenmesi nöronal devrelerin fonksiyonunu değerlendirmek için yararlı stratejiler olanaklı kılmak. Burada, farelerin uyku aşamasını değerlendirmek için elektroensefalogram (EEG) ve elektromiyogram (EMG) izleme sırasında belirli bir kimyasal kimliğe sahip olan nöronların optogenetik manipülasyonunun etkisini incelemek için bir teknik açıklanmaktadır. Örneğin, biz stria terminalis (BNST) yatak çekirdeğinde GABAerjik nöronların manipülasyon açıklanmaktadır. Bu nöronların akut optogenetik uyarılması NREM uyku sırasında uygulandığında uyanıklık hızlı bir geçiş tetikler. EEG/EMG kayıt ile birlikte optogenetik manipülasyon uyku/uyanıklık Devletler düzenleyen nöronal devreler deşifre için uygulanabilir.

Introduction

Optimum bilişsel fonksiyon için uyku önemlidir. Son bulgular da uyku bozuklukları çeşitli hastalıklar ile ilişkili olduğunu düşündürmektedir1,2,3. Uyku fonksiyonları henüz büyük ölçüde çözülmemiş olmasına rağmen, son zamanlarda sinir devreleri ve uyku/uyanıklık Devletler4kontrol mekanizmaları anlamada önemli ilerleme yapılmıştır. Memelilerde, uyanık üç devlet vardır: uyanıklık, hızlı olmayan göz hareketi (NREM) uyku, ve hızlı göz hareketi (REM) uyku. Uyanıklık, hızlı EEG osilasyonlarıyla (5-12 Hz), maksatlı ve sürekli motor aktivitesi ile düşük amplitüd ile karakterize edilir. NREM uyku (1-4 Hz) yüksek amplitüd (Delta dalgaları), bilinç eksikliği ve amaç motor aktivitesi ile yavaş salınımlar tarafından tanımlanır. REM uykusu nispeten hızlı salınımlar (6-12 Hz) düşük amplitüd ve neredeyse komple bilateral kas atonia5ile karakterize edilir.

Borbely, iki proses modeli6,7olarak bilinen uyku-uyanıklık Yönetmeliği teorisi önerdi. Bir homeostatik süreç, aynı zamanda işlem S olarak adlandırılır, uyanıklık sırasında birikir ve uyku sırasında dağılıyor uyku basıncını temsil eder. C süreci olarak adlandırılan bir başka süreç ise, 24 saat döngüsünde neden uyanık düzeylerinin dalgalanacağını açıklayan bir sirkadiyen süreçtir. Bu iki süreçlere ek olarak, allostatik faktörler uyku/uyanıklık8,9düzenlenmesi için de önemlidir. Allostatic faktörler beslenme durumları ve duygu içerir. Korku ve anksiyete genellikle otozik ve nöroendokrin tepkiler ile birlikte uyarılma artışı eşlik eder10,11,12. Limbik sistem korku ve anksiyete düzenlenmesi bir rol oynamaya inanılır, ve otonjik ve nöroendokrin tepkiler altta yatan mekanizmalar kapsamlı olarak incelenmiştir, ancak limbik sistem uyku/uyanıklık durumları etkileyen yol değil henüz ortaya çıktı. Opto-ve Farmakogenetik kullanan son çalışmalar çok sayıda nöronlar ve uyku/uyanıklık Devletler düzenleyen nöronal devrelerin beyin boyunca dağıtılır önerdi, korsinler dahil, bazal forebrain, talamus, hipotalamus, ve beyin kökü. Özellikle, optogenetik son gelişmeler bize uyarmak veya belirli nöral devreler in vivo yüksek uzamsal ve temporal çözünürlüklerde inhibe izin verdik. Bu teknik uyku ve uyanıklık nöral substratlar bizim anlayışımızda ilerleme sağlayacak, ve nasıl uyku/uyanıklık Devletler sirkadiyen süreçleri tarafından düzenlenir, uyku basıncı, ve allostatik faktörler, duygu dahil. Bu yazıda, NREM uyku, REM uyku düzenlenmesi bir rol oynayan beyinde konektoumunu ve mekanizmalar bizim anlayışımızı güncellemek için potansiyeli olabilir uyku/uyandırma kaydı ile birlikte optogenetik manipülasyon nasıl kullanılacağı tanıtmak amaçlamaktadır, ve uyanıklık. Hangi limbik sistem uyku/uyanıklık Devletler düzenleyen bu mekanizmanın anlayış sağlık için önemli bir önem taşımaktadır, çünkü uykusuzluk genellikle anksiyete ya da uyku mümkün olma korkusu ile ilişkilidir (somniphobia).

BNST anksiyete ve korku önemli bir rol oynamak için düşünülmektedir. Gad 67-gabaergic nöronlar ifade bnst12,13büyük bir nüfus vardır. Biz bu nöronların optogenetik manipülasyon etkisini inceledi (GABABnst) uyku/uyanıklık Devletler. Son yıllarda Nörobilim en büyük gelişmelerden biri, yüksek uzamsal ve temporal çözünürlüklerde ile, özel kimyasal kimlikleri in vivo ile nöronların manipülasyon sağlayan yöntemler olmuştur. Optogenetiği nöral aktivite ve spesifik davranışsal tepkiler14arasındaki nedensel bağlantıları göstermek için son derece yararlıdır. Biz uyku/uyanıklık devletlerin düzenlenmesi tanımlanan nöral devrelerin işlevsel bağlantı incelemek için bir yöntem olarak optogenetik tarif. Bu tekniği kullanarak, uyku/uyanıklık durumları düzenleyen nöronal devreleri anlamak için büyük bir ilerleme elde edilmiştir15,16,17,18,19 . Birçok durumda, opsins özellikle CRE-sürücü fareler ve CRE-indüklenebilir AAV aracılı gen transfer kombinasyonu ile seçici beyin bölgelerinde belirli kimyasal kimlikleri ile nöronlar tanıtıldı. Ayrıca, bir CRE-loxP veya FLP-FRT sistemi ile birlikte channelrhodopsin 2 (ChR2)20 veya archaerhodopsin (archt)21 gibi fotoğraf duyarlı opgünahların fokal ifade bize seçici bir nöronal nüfus ve spesifik manipüle sağlar nöral yol22.

Biz burada bir örnek olarak BNST içinde GABAergic nöronlar üzerinde deneyler tarif. Belirlenmiş bir nöronal nüfus opsins ifade etmek için, uygun CRE sürücü fareler ve CRE bağımlı virüs vektörler en sık kullanılır. Opgünahların özellikle nöronal nüfus içinde ifade edildiği transgenik veya Knock-in hatları da yararlıdır. Aşağıdaki deneyler, biz kullanılan GAD67-CRE Knock-in fareler23 hangi sadece gabaergic nöronlar bir C57BL/6J genetik arka plan ile CRE Rekombinaz Ifade, ve bir AAV vektörü IÇEREN ChR2 (hChR2 H134R) BIR kontrol olarak EYFP veya EYFP ile kaynama “FLEx (Flip-eksizyon) anahtarı” ile24. Prosedür özellikle uyku/uyanıklık Devletler25izlenmesi sırasında bnst Içinde gabaeroid nöronların optogenetiği uyarılma açıklanmaktadır.

Protocol

Buradaki tüm deneyler, NıH kurallarına uymak üzere Tsukuba Üniversitesi hayvan deneyi ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. hayvan cerrahisi, virüs enjeksiyonu, EEG/EMG ve optik fiber Implantasyon için elektrot Dikkat: Kullanılacak virüsün Biyogüvenlik düzeyine göre uygun koruma ve işleme teknikleri seçilmelidir. AAV enjeksiyon için yalıtılmış bir P1A dereceli odada kullanılmalıdır, ve AAV taşıyan tüp…

Representative Results

Bu çalışmada GABABnst nöronların optogenetik uyarma etkisi uyku durumu geçiş gösterdi. ChR2-EYFP ekspresyonu bnst GABA nöronlar ifade edildi. Bir in situ hibridizasyon histokimyasal çalışmada ChR2-EYFP, bu GABAerjik nöronlar olduğunu gösteren, Gad 67 mRNA sinyalleri ifade nöronlar içinde kolokalize olduğunu gösterdi. İmmunohistokimyasal dilim numuneleri, ucu BNST25′ in hemen üstünde olan optik lifin konumunu doğruladı. <p clas…

Discussion

Biz burada uyku/uyanıklık devlet geçişleri üzerinde belirli kimyasal kimlikleri ile nöronların optogenetik stimülasyon etkisini değerlendirmek için bir yöntem sundu ve GABABnst nöronların manipülasyon bir örnek verdi. Bizim veri gösterdi GABAbnst nöronlar optogenetic uyarılma wakefulness NREM uyku hemen geçiş sonuçları.

Çeşitli Deneysel tasarımlar, birçok türde optogenetik araç gelişimi nedeniyle mevcuttur. Etkinleştirmek ya da ChR2, SSFO, ha…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışmada, Merck araştırmacı çalışmalar programı (#54843), bir KAKENHI Grant-in-yardım yenilikçi alanlar üzerinde bilimsel araştırma için, “WillDynamics” (16H06401) (T.S.) ve bir KAKENHI Grant-in-yardım yenilikçi alanlar (T.S.) üzerinde keşif araştırması için destek oldu (18H02595).

Materials

1×1 Fiber-optic Rotary Joints Doric FRJ 1×1 FC-FC for optogenetics
6-pin header KEL corporation DSP02-006-431G
6-pin socket Hirose 21602X3GSE
A/D converter Nippon koden N/A Analog to digital converter
AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP 3.70×1013(genomic copies/ml)
AAV10-EF1a-DIO-EYFP 5.82×1013(genomic copies/ml)
Ampicillin Fuji film 014-23302
Amplifier Nippon koden N/A for EEG/EMG recording
Anesthetic vaporizer Muromachi MK-AT-210D
Automatic injecter KD scientific 780311
Carbide cutter Minitor B1055 φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor 
Cyanoacrylate adhesion  (Aron alpha A) and acceleration Konishi #30533
Dental curing light 3M Elipar S10
Epoxy adhesive Konishi #04888 insulation around the solder of 6-pin and shielded cable
Fiber optic patch cord (branching) Doric BFP(#)_50/125/900-0.22
Gad67-Cre mice provided by Dr. Kenji Sakimura Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele
Hamilton syringe Hamilton 65461-01
High speed rotary micromotor kit FOREDOM K.1070 Used with carbide cutter
Interconnecting sleeve Thorlab ADAF1 φ2.5 mm Ceramic 
Isoflurane Pfizer 871119
Laser   Rapp OptoElectronic N/A 473nm wave length
Laser intesity checker COHERENT 1098293
Laser stimulator Bio research center STO2 reffered as pulse generator in text
Optic fiber with ferrule  Thorlab FP200URT-CANNULA-SP-JP
pAAV2-rh10 provided by PennVector Core
pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA Addgene plasimid # 20296
pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA provided by Dr. Karl Deisseroth
Patch cord Doric D202-9089-0.4 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint
pHelper Stratagene
Photocurable dental cement 3M 56846
Serafin clamp Stoelting 52120-43P
Shielded cable mogami W2780 Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording
Sleep recording chamber N/A N/A Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder
Sleep sign software KISSEI COMTEC N/A for EEG/EMG analysis
Slip ring neuroscience,inc N/A for EEG/EMG analysis
Stainless screw Yamazaki N/A φ1.0 x 2.0
Stainless wire Cooner wire AS633  0.0130 inch diameter
Stereotaxic frame with digital console Koph N/A Model 940
Syringe needle Hamilton 7803-05
Vital recorder software KISSEI COMTEC N/A for EEG/EMG recording

Referanslar

  1. Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?. Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
  2. Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
  3. Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
  4. Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
  5. Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
  6. Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
  7. Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
  8. Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
  9. Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
  10. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
  11. Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
  12. Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
  13. Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
  14. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
  15. de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
  16. Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
  17. Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
  18. Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
  19. Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
  22. Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
  23. Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
  24. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
  25. Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
  26. Lin, F., Pichard, J. . Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).
  27. Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
  28. Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice. J. Vis. Exp. (148), e58613, doi:10.3791/58613 (2019).

View Video