Aquí, describimos métodos de manipulación optogenética de determinados tipos de neuronas durante la monitorización de los estados de sueño/vigilia en ratones, presentando nuestro trabajo reciente en el núcleo de la estría terminal is como ejemplo.
En los últimos años, la optogenética ha sido ampliamente utilizada en muchos campos de la investigación neurocientífica. En muchos casos, una opsin, como la rodopsina de canal 2 (ChR2), se expresa mediante un vector de virus en un tipo particular de células neuronales en varios ratones Cre-driver. La activación de estas opsins se activa mediante la aplicación de pulsos de luz que se entregan por láser o LED a través de cables ópticos, y el efecto de la activación se observa con una resolución de tiempo muy alta. Los experimentadores son capaces de estimular agudamente las neuronas mientras monitorean el comportamiento u otro resultado fisiológico en ratones. La optogenética puede permitir estrategias útiles para evaluar la función de los circuitos neuronales en la regulación de los estados de sueño/vigilia en ratones. Aquí describimos una técnica para examinar el efecto de la manipulación optogenética de las neuronas con una identidad química específica durante el electroencefalograma (EEG) y la monitorización del electromiograma (EMG) para evaluar la etapa del sueño de los ratones. Como ejemplo, describimos la manipulación de las neuronas GABAérgicas en el núcleo de la cama de la estría terminalis (BNST). La excitación optogenética aguda de estas neuronas desencadena una rápida transición a la vigilia cuando se aplica durante el sueño NREM. La manipulación optogenética junto con la grabación EEG/EMG se puede aplicar para descifrar los circuitos neuronales que regulan los estados de sueño/vigilia.
El sueño es esencial para una función cognitiva óptima. Los hallazgos recientes también sugieren que las alteraciones en el sueño se asocian con una amplia gama de enfermedades1,2,3. Aunque las funciones del sueño están todavía en gran medida sin resolver, recientemente se han hecho progresos sustanciales en la comprensión de los circuitos neuronales y mecanismos que controlan los estados de sueño/vigilia4. En los mamíferos, hay tres estados de vigilancia: vigilia, sueño de movimiento ocular no rápido (NREM) y sueño de movimiento ocular rápido (REM). La vigilia se caracteriza por oscilaciones EEG rápidas (5-12 Hz) de baja amplitud con actividad motora intencionada y sostenida. El sueño NREM se define por oscilaciones lentas (1-4 Hz) de alta amplitud (ondas delta), con falta de conciencia y actividad motora deliberada. El sueño REM se caracteriza por oscilaciones relativamente rápidas (6-12 Hz)de baja amplitud y casi completa atonía muscular bilateral 5.
Borbely propuso una teoría de la regulación de la vigilia del sueño conocida como los dos modelos de proceso6,7. Un proceso homeostático, también conocido como proceso S, representa la presión del sueño que se acumula durante la vigilia y se disipa durante el sueño. Otro proceso, conocido como proceso C, es un proceso circadiano, que explica por qué los niveles de vigilancia fluctúan en el ciclo de 24 h. Además de estos dos procesos, los factores alostáticos también son importantes para la regulación del sueño/vigilia8,9. Los factores allostáticos incluyen estados nutricionales y emociones. El miedo y la ansiedad suelen ir acompañados de un aumento de la excitación junto con las respuestas autonómicas y neuroendocrinas10,11,12. Se cree que el sistema límbico desempeña un papel en la regulación del miedo y la ansiedad, y los mecanismos subyacentes a las respuestas autonómicas y neuroendocrinas se han estudiado extensamente, pero la vía por la cual el sistema límbico influye en los estados de sueño/vigilia no ha sido aún así se han revelado. Un gran número de estudios recientes con opto- y farmacogenética han sugerido que las neuronas y circuitos neuronales que regulan los estados de sueño/vigilia se distribuyen por todo el cerebro, incluyendo los cortices, el antecefálico basal, el tálamo, el hipotálamo, y el tallo cerebral. En particular, los recientes avances en optogenética nos han permitido estimular o inhibir circuitos neuronales específicos in vivo con altas resoluciones espaciales y temporales. Esta técnica permitirá avanzar en nuestra comprensión de los sustratos neuronales del sueño y la vigilia, y cómo los estados de sueño/vigilia están regulados por procesos circadianos, presión de sueño y factores alostáticos, incluyendo la emoción. Este artículo tiene como objetivo introducir cómo utilizar la manipulación optogenética combinada con la grabación de sueño/vigilia, que podría tener el potencial de actualizar nuestra comprensión de los connectomes y mecanismos en el cerebro que juegan un papel en la regulación del sueño NREM, sueño REM, y la vigilia. La comprensión de este mecanismo por el cual el sistema límbico regula los estados de sueño/vigilia es de suma importancia para la salud, porque el insomnio generalmente se asocia con la ansiedad o el miedo a no poder dormir (somnifobia).
Se cree que el BNST juega un papel esencial en la ansiedad y el miedo. GAD 67-expresando neuronas GABAérgicas son una población importante del BNST12,13. Examinamos el efecto de la manipulación optogenética de estas neuronas (GABABNST) en estados de sueño/vigilia. Uno de los mayores avances en neurociencia en los últimos años han sido los métodos que permiten la manipulación de las neuronas con identidades químicas particulares in vivo, con altas resoluciones espaciales y temporales. La optogenética es muy útil para demostrar vínculos causales entre la actividad neuronal y las respuestas conductuales específicas14. Describimos la optogenética como un método para examinar la conectividad funcional de los circuitos neuronales definidos en la regulación de los estados de sueño/vigilia. Mediante la utilización de esta técnica, se ha logrado un gran progreso en la comprensión de los circuitos neuronales que regulan los estados de sueño/vigilia15,16,17,19,19 . En muchos casos, las opsins se introducen específicamente en neuronas con identidades químicas particulares en regiones cerebrales selectivas mediante una combinación de ratones Cre-driver y transferencia de genes mediada por AAV inducible Cre. Además, la expresión focal de opsins fotosensibles como la cifrodopsina 2 (ChR2)20 o la arqueerhodopsina (ArchT)21 combinada con un sistema Cre-loxP o Flp-FRT nos permite manipular una población neuronal selectiva y específica vía neural22.
Aquí describimos los experimentos sobre neuronas GABAérgicas en el BNST como un ejemplo. Para expresar opsins en una población neuronal designada, se utilizan con mayor frecuencia ratones conductores de Cre apropiados y vectores de virus dependientes de Cre. También son útiles las líneas transgénicas o de impacto en las que las opsins se expresan en determinadas poblaciones neuronales. En los siguientes experimentos, utilizamos ratones knock-in GAD67-Cre 23 en los que sólo las neuronas GABAérgicas expresan la recombinación de Cre con un fondo genético C57BL/6J, y un vector AAV que contiene ChR2 (hChR2 H134R) fusionado con EYFP o EYFP como un vector de control con un interruptor “FLEx (Flip-escision)”24. El procedimiento describe específicamente la excitación optogenética de las neuronas GABAérgicas en el BNST durante el seguimiento de los estados de sueño/vigilia25.
Aquí presentamos un método para evaluar el efecto de la estimulación optogenética de las neuronas con identidades químicas particulares en las transiciones de estado de sueño / vigilia y dio un ejemplo de manipulación de las neuronas GABABNST. Nuestros datos mostraron que la excitación optogenética de las neuronas GABABNST resulta en la transición inmediata del sueño NREM a la vigilia.
Varios diseños experimentales están disponibles debido al desarrollo de nu…
The authors have nothing to disclose.
Este estudio fue apoyado por el Programa de Estudios de Investigadores de Merck (#54843), una Subvención en Ayuda para La Investigación Científica de KAKENHI sobre áreas innovadoras, “WillDynamics” (16H06401) (T.S.) y una Subvención en Ayuda de KAKENHI para Investigación Exploratoria en Áreas Innovadoras (T.S.) (18H02595).
1×1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1×1 FC-FC | for optogenetics |
6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473nm wave length |
Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
pHelper | Stratagene | ||
Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder |
Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |