Manipolazione optogenetica dei circuiti neurali durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi

Il sonno è essenziale per una funzione cognitiva ottimale. Recenti scoperte suggeriscono anche che i disturbi nel sonno sono associati a una vasta gamma di malattie^1,2,3. Anche se le funzioni del sonno sono ancora in gran parte irrisolte, progressi sostanziali sono stati fatti di recente nella comprensione dei circuiti neurali e dei meccanismi che controllano il sonno / veglia stati⁴. Nei mammiferi, ci sono tre stati di vigilanza: veglia, sonno non rapido degli occhi (NREM), e rapido movimento degli occhi (REM) sonno. La Veglia è caratterizzata da oscillazioni EEG veloci (5-12 Hz) di bassa ampiezza con un’attività motoria mirata e sostenuta. Il sonno NREM è definito da oscillazioni lente (1-4 Hz) di alta ampiezza (onde delta), con mancanza di coscienza e attività motoria mirata. Il sonno REM è caratterizzato da oscillazioni relativamente veloci (6-12 Hz) di bassa ampiezza e atonia muscolare bilaterale quasi completa⁵.

Borbely ha proposto una teoria della regolazione della veglia del sonno nota come il modello di processo a due^6,7. Un processo omeostatico, indicato anche come processo S, rappresenta la pressione del sonno che si accumula durante la veglia e si dissipa durante il sonno. Un altro processo, indicato come processo C, è un processo circadiano, che spiega perché i livelli di vigilanza fluttuano nel ciclo di 24 h. Oltre a questi due processi, fattori allostatici sono anche importanti per la regolazione del sonno/ veglia^8,9. I fattori allostatici includono stati nutrizionali ed emozioni. La paura e l’ansia sono di solito accompagnate da un aumento dell’eccitazione insieme alle risposte autonomiche e neuroendocrine^10,11,12. Si ritiene che il sistema limbico svolgi un ruolo nella regolazione della paura e dell’ansia, e i meccanismi alla base delle risposte autonome e neuroendocrine sono stati studiati ampiamente, ma il percorso attraverso il quale il sistema limbico influenza gli stati di sonno/veglia non ancora rivelato. Un gran numero di studi recenti che utilizzano opto e farmacogenetica hanno suggerito che i neuroni e i circuiti neuronali che regolano gli stati di sonno/veglia sono distribuiti in tutto il cervello, tra cui cortice, prosencefalo basale, talamo, ipotalamo, e il tronco encefalico. In particolare, i recenti progressi nell’optogenetica ci hanno permesso di stimolare o inibire specifici circuiti neurali in vivo con elevate risoluzioni spaziali e temporali. Questa tecnica permetterà di progredire nella nostra comprensione dei substrati neurali di sonno e veglia, e come gli stati di sonno / veglia sono regolati da processi circadiani, pressione del sonno, e fattori allostatici, tra cui l’emozione. Questo documento ha lo scopo di introdurre come utilizzare la manipolazione optogenetica combinata con la registrazione sonno/veglia, che potrebbe avere il potenziale per aggiornare la nostra comprensione dei connettomi e dei meccanismi nel cervello che svolgono un ruolo nella regolazione del sonno NREM, del sonno REM, e la veglia. La comprensione di questo meccanismo con cui il sistema limbico regola gli stati di sonno/veglia è di fondamentale importanza per la salute, perché l’insonnia è di solito associata all’ansia o alla paura di non riuscire a dormire (somnifobia).

Si ritiene che il BNST svolgga un ruolo essenziale nell’ansia e nella paura. GAD 67-esprimendo neuroni GABAergic sono una popolazione maggiore del BNST^12,13. Abbiamo esaminato l’effetto della manipolazione optogenetica di questi neuroni (GABA^BNST) sugli stati di sonno/ veglia. Uno dei più grandi progressi nelle neuroscienze negli ultimi anni sono stati i metodi che consentono la manipolazione di neuroni con particolari identità chimiche in vivo, con alte risoluzioni spaziali e temporali. L’optogenetica è molto utile per dimostrare i collegamenti causali tra l’attività neurale e le risposte comportamentali specifiche¹⁴. Descriviamo l’optogenetica come un metodo per esaminare la connettività funzionale dei circuiti neurali definiti nella regolazione degli stati di sonno/veglia. Utilizzando questa tecnica, sono stati compiuti grandi progressi nella comprensione dei circuiti neuronali che regolano gli stati di sonno/veglia^{15,16,17,18,19} . In molti casi, gli opsin sono specificamente introdotti nei neuroni con particolari identità chimiche nelle regioni cerebrali selettive da una combinazione di topi Cre-driver e trasferimento genico mediato da Cre-inducible AAV. Inoltre, l’espressione focale di opsine fotosensibili come la channelrhodopsin 2 (ChR2)²⁰ o l’archeerhodopsin (ArchT)²¹ combinata con un sistema Cre-loxP o Flp-FRT ci permette di manipolare una popolazione neuronale selettiva e specifica percorso neurale²².

Descriviamo qui esperimenti sui neuroni GABAergici nel BNST come esempio. Per esprimere le operazioni in una popolazione neuronale designata, i topi del conducente Cre appropriati e i vettori del virus dipendenti dal Cre sono più frequentemente utilizzati. Sono utili anche linee transgeniche o knock-in in cui le opsine sono espresse in particolari popolazioni neuronali. Nei seguenti esperimenti, abbiamo usato i topi Knock-in GAD67-Cre ²³ in cui solo i neuroni GABAergici esprimono la Ricombinani Cre con un background genetico C57BL/6J e un vettore AAV che contiene ChR2 (hChR2 H134R) fuso con EYFP o EYFP come controllo con un interruttore “FLEx (Flip-excision)”²⁴. La procedura descrive specificamente l’eccitazione optogenetica dei neuroni GABAergici nel BNST durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia²⁵.