이 프로토콜에는 분리 하 고 마우스 기본 신장 관 세포 이후에 하위 신장 생물학 기능 비보 전, 미토 콘 드리 아 생체를 포함 하 여 평가 양식 수 있는 특성화 하는 비용 효율적인 접근 방식을 제공 합니다.
신장 관 상피 세포 (TECs)에서 미토 콘 드 리아 기능 장애는 신장 섬유 증, 만성 신장 병 (CKD)의 주요 원인으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 기본 TECs 미토 콘 드 리아 기능 평가 CKD의 이상에 대 한 통찰력을 제공 하는 셀의 bioenergetic 상태에 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 분리와 다른 종에 인접 tubules의 정화 하는 데 사용할 수 있는 복잡 한 프로토콜 수 있지만, 필드 정화에 대 한 필요 없이 관 세포 격리에 대 한 최적화 된 비용 효율적인 방법을 결여 된다. 여기, 우리는 두 주에 초점을 맞추고 연구 인접 하 고 원심 신장 TECs 마우스에 대 한 수 있는 격리 프로토콜을 제공 합니다. 비용 효과적인 시 약 및이 프로토콜에 필요한 최소한의 동물 절차, 고립 된 세포 격리 후 높은 에너지 레벨을 유지 하 고 하위 4 구절, 지속적인 연구에 대 한 허용 최대 경작 될 수 있다. 또한, 우리는 우리 세포 밀도 및 화합물 농도의 최적화에 대 한 권장 사항을 제공 96 잘 접시에 격리 TECs에서 직접 미토 콘 드리 아 호흡을 평가 높은 처리량 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여. 이러한 관측 신장 TECs의 일관 된, 잘 표준화 된 생산 신장 관 ex vivo 연구이 프로토콜을 사용할 수 있는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 광범위 한 미래의 응용 프로그램에서 약물 발견 또는 마약 특성화 목적에 대 한 신장 장애와 관련 된 미토 콘 드 리아 기능 장애 연구 할 수 있습니다.
신장 관 상피 세포 (TEC) 기능 신장의 전반적인 건강 상태와 강하게 연결 됩니다. 신장에 병 적인 신호 신장 섬유 증 및 만성 신장 병 (CKD)1,2에서 중요 한 역할을, TECs dedifferentiation을 발생 합니다. 높게 정력적 인 기관으로 신장은 주로 미토 콘 드 리아 산화 인 산화3통해 산소 소비량, 심장에만 두 번째. 전자 현미경 연구는 미토 콘 드 리아 형태학 변화 신장 tubules4병 적인 이벤트의 긍정적인 상관 관계를 밝혀 있다. TECs 미토 콘 드 리아 장애 신장 섬유 증에 엽 상피 전환5 와 불완전 지방산 산화6통해 발생합니다. 섬유 증은 CKD 귀착되는 진보적인 신장 병 리 이다. 따라서, 신장 TECs의 에너지 상태를 이해 CKD의 이상 발견 하는 필요 이다.
성인 신장7> 20 종류 있다. TECs의 기능을 공부, 신장 상피 세포의 기본 문화 화학 치료 및 유전자 조작 등 분자 생물학 응용 프로그램을 위한 플랫폼으로 필요 하다. 중요 한 것은, 유전자 조작은 vivo에서 쥐 transgenesis 또는 고립 된 주 세포 유전자 조작 이미 것 있도록 AAV 유전자 전달 기법8 을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 마우스9,10, 쥐11,,1213,14개, 토끼15,16및 인간17에서 기본 신장 관 세포의 고립 ,18 순수 근 관 세포를 정화 단계와 보고 되었습니다. 이 이전에 게시 프로토콜 인접 관 세포의 고립에 초점을, 그라데이션 원심 분리 및 실험 정렬 정화 목적으로19수행 했다. 이러한 프로토콜 인접 tubules 공부에 대 한 귀중 한 동안, 그들은 충분 하지 않습니다 인접 및 원심 tubules 공부 하는 데 필요한 때. 예를 들어 Alport 증후군에 대 한 우리의 연구는 인접 및 원심 신장 tubules20질병 진행 중요 한 역할을 따라서 신장 tubules의 두 종류 문화 조사 한다 밝혔다. 신장 불 화물 독성에 대 한 최근 연구는 또한 병리학 변화 모두는 근 위 및 원심 tubules21에서 개최 했다 다는 것을 보여주었다. 따라서,이 격리 프로토콜 설계 및 시 약 및 간단한 절차의 최소한의 비용으로 마우스 신장에서 인접 하 고 원심 관 세포에 대 한 최적화. 또는 수 사관 수 여전히 프로토콜 단계 3.1까지 따라 하 고 순수한 근 관 세포의 고립에 대 한이 시점에서 정화 단계9 를 추가.
고립 된 세포 높은 에너지 레벨을 제시 하 고 4 구절에 하위 문화 후 신장 상피 특성을 유지. 높은 처리량 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여, 우리 셀 밀도 최적화로 더 통찰력에 이르게는 96 잘 접시에서 격리 TECs에서 직접 미토 콘 드리 아 호흡을 평가 합니다. 이러한 관찰이이 프로토콜 신장 TECs의 일관 된, 잘 표준화 된 생산 신장 관 ex vivo 연구에 적용할 수 있는 것이 좋습니다. 이 프로토콜의 추가 의미 신장 근 위 및 원심 관 세포에서 미토 콘 드리 아 생체 ex vivo 특성에 대 한 높은 처리량 도구로 그것의 가능한 사용 이다. 따라서, 그것은 약물 발견 또는 신장 질환의 약물 특성화 목적을 위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.
우리 마우스 신장 관 상피 세포 (TECs)의 효율적인 절연을 허용 하는 프로토콜을 최적화 하 고 그 셀 하위 존재 지방산-미토 콘 드리 아 호흡을 평가 하는 세포 외 유출 분석에 대 한 교양 있을 수 있습니다 보였다 또는 포도 당-기반 기판입니다. 이 프로토콜 인접 및 원심 관 세포에 초점을 맞추고 연구 설계 및 TEC 병리학 관련 신장 질병의 이해에 대 한 더 복잡 한 실험을 구축 하는 프레임 워크 역할. 이전에 게시 프로토콜9,,1019에 비해,이 필요 하지 않습니다 긴 원심 분리 시간 또는 충분 한 항 체 사용 그라데이션 분판을 정렬 방법과, 따라서, 더 많은 제공 합니다. 신장 관 대사 분야에서 일 하는 연구원에 대 한 효율적이 고 최적화 된 가이드. 소화, 다시 컬렉션 및 도금 밀도 세포 외 유출 분석 결과 대 한 복합 최적화를 포함 하 여이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다.
콜라와 최적 농도의 올바른 유형을 선택 신장 조직에서 성공적인 소화 관 세포의 분리에 열쇠 이다. Collagenases의 다른 종류에 비해, 2 형 콜라 효소 활동, 소형 신장 구조를 해리의 능력의 상대적으로 높은 수준을 포함 합니다. 장기 관류와 소화 시간 오염 가능성을 최소화 하려면 0.013 %2 형 콜라는 30 mL/min에 끼얹는다. 신장 캡슐 두 신장 동물에서 수확 하 고 멸 균된 셀 문화 후드로 전송 했다 후에 제거 되었다. 신장 작은 조각으로 다진 했다 고 소화 버퍼를 완전 한 소화 관 세포의 최대한 출시에 대 한 또 다른 5 분의 10 mL와 함께 그들의 부 화를 계속 했다.
하지만, 소화, 후 조직 정지는 매우 큰 조직 조각을 제거를 70 µ m 필터를 통해 전달 됩니다, 아직 소화 되지 않은 tubules 필터를 통과 하 고 세포 현 탁 액 내 문화 접시에 도금을 얻이 있을 것입니다. 그것은 이러한 tubules를 관 세포를 문화 접시를 단단히 연결에 대 한 정상 보다 더 긴 시간이 걸립니다. 따라서, 세포 현 탁 액을 수집 하 여 작은 첨부 되지 않은 tubules 및 셀 셀 도금 후 두 번째 날을 원심 오히려 중요 하다. 이 저속 원심 분리 단계는 더 관 세포 보다는 다른 세포 유형 제거 하 고 첨부 되지 않은 tubules 및 관 세포 정착.
적절 한 셀 밀도의 식별 성공적인 세포 외 유출 분석 결과 대 한 첫 번째 주요 단계입니다. 결과 XF96 microplate에 잘 당 40, 000 셀 기본 관 셀 지방산과 포도 당 기반 호흡 분석 결과 (그림 3C)에 대 한 이상적입니다 나타났다. 이 프로토콜에서 격리 된 관 세포 구절 1과 2에서 세포 외 유출 분석 결과 대 한 사용 되었다. 하위 3, 비록 그들이 유지 관 표식 (그림 2)와 (그림 3A), 생체 분석 실험에서 괜찮은 성능을 표현의 통로 2에 비해 감소 기저 호흡 수준을 보여주었다 통로를 경작 하는 세포 ( 그림 3C를 그림 3A 의 오른쪽 패널에서 OCR을 비교 하 여 표시). 이 감소는 (예를 들어 젊은 야생-타입 마우스에서 고립 된 사람) 실질적으로 건강 한 관 세포에 영향을 미치지 않을 수 있습니다. 그러나, 이미 저하 미토 콘 드리 아 호흡 CKD 마우스 모델에서 격리 하는 셀에 대 한 연구, 대 한 세포의 높은 구절 기저 호흡 세포 외 유출 분석 결과의 결과 영향을 미칠 것 이라고 더 감소를 발생할 수 있습니다. 연구에서 통로 1 및 보여준 높은 통로 2 기저 호흡 수준에서 세포, 실시. 따라서,이 프로토콜에 따라 모두 건강 하 고 병에 걸린 동물에서 분리 된 세포와 미토 콘 드리 아 호흡 연구에 대 한 이러한 두 초기 구절을 사용 하 여 것이 좋습니다. 통로 2에서 셀 통로 1 하위 문화 플럭스 분석 결과 대 한 충분 한 세포를 생성 하지 않습니다 경우 고려 사항으로가지고 아직도 한다. 생체 연구 뿐만 아니라 우리의 이전 연구 통로 3에 기본 TECs 단백질 및 RNA 연구 (데이터 표시 되지 않음) 화합물과 치료에 대 한 매우 유용한 수 있습니다 보여줍니다. 그 말했다 하 고, 좋습니다 조사 관 세포를 분리 하는이 프로토콜을 사용 하 여 다른 연구 응용 프로그램에 대 한 최적의 통로 선택 신중 하 게 해야 한다.
세포 외 유출 분석의 작동 원리 삽입 된 화합물과 호흡 사슬 복합물 및는 uncoupler의 효과 사이의 상호 작용을 기반으로 합니다. Oligomycin 복잡 한 V (ATP synthase)의 억제제 이며 ATP 연결 산소 소비와 미토 콘 드리 아 내 막32에 걸쳐 일반 양성자 누출을 극복 하는 데 필요한 산소 소비를 구별 하는 데 사용 합니다. FCCP 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 방해 하 여 ATP 생산에서 산소 소비를 uncouples. 따라서, 그것은 그것은 멤브레인을 통해 양성자 전송 함으로써 ATP synthase에 의해 양성자 이온 경과의 제한 된 용량 circumvents로 최대한 호흡 능력의 측정을 제공 한다. Antimycin-A, 복잡 한 III 억제제, 그리고로 테 논, 복잡 한 내가 차단, 허용은 미토 콘 드리 아 대 사이 감 별 법에 비-미토 콘 드 리아 산소 소비 전체 미토 콘 드리 아 호흡을 조합에서 이용 된다 셀입니다. 이 화합물은 최적의 OCR 곡선을 생성 하는 최적의 농도 결정 하는 세포 외 유출 분석 결과 전에 특정 셀 형식에 대 한 항상 적정 한다. 여기, oligomycin, FCCP의 1 개의 µ M 그리고로 테 논/antimycin A 기본 TECs에 세포 외 유출 분석 결과 대 한의 2 µ M의 1 µ M이 좋습니다.
결론적으로,이 프로토콜에는 신장 주 근 및 원심 관 상피 세포 미토 콘 드리 아 생체 비보 전평가에 사용할 수 있는 격리 하는 간단 하 고 비용 효율적인 방법을 제공 합니다. 이 프로토콜은 신장 관 상피 세포의 생물학 기능을 탐구 하는 분자 생물학 연구의 넓은 범위에서 유용할 수 있습니다, 우리 순수 인접 또는 원심 tubules를 필요로 하는 연구에 적용의 한계 인정 합니다. 예를 들어 로우 증후군, 선택적인 근 관 부전33또는 원심 신장 관 산 성 증, 원심 관 부전34에 대 한 연구에 대 한 연구 필요 더 정교한 프로토콜 셀 격리 및 정화입니다. 그러나, tubules 대 glomeruli, 비교 연구의 대다수 및 연구 관 세포에 잠재적인 미토 콘 드리 아 호흡 레 귤 레이 터를 일반적으로 화면에 가능한 높은 처리량 접근을 프로토콜에 제공 합니다. 따라서,이 프로토콜 광범위 한 응용 프로그램에서 미토 콘 드리 아 역 기능 약물 발견 또는 대상 유효성 검사 목적으로 신장 장애와 관련 된 공부를 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품을 리 나 A. Shehadeh 다음 교부 금에 의해 지원 되었다:는 건강의 국립 연구소 (R56HL132209 및 1R01HL140468)와 마이애미 심장 연구소.
Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |