פרוטוקול זה מספק גישה חסכונית כדי לבודד ולאפיין העכבר הראשי כליות צינורי תאים יכולים לאחר מכן להיות תת תרבותי להערכת תפקודים ביולוגיים כליות ex-vivo, כולל ביואנרגיה מיטוכונדריאלי.
תפקוד מיטוכונדריאלי בתאי אפיתל אבובית הכליה (אקדח) יכול להוביל פיברוזיס כליות, מחלת כליות כרונית (CKD) הגורם העיקרי. לכן, הערכת פונקציית מיטוכונדריאלי אקדח העיקרי עשוי לספק תובנות בעלות ערך לתוך המצב bioenergetic של התאים, לספק תובנה הפתופיזיולוגיה של CKD. אמנם ישנם מספר פרוטוקולים מורכבים זמין עבור בידוד ולטיהור בקוריאנית proximal מינים שונים, השדה חסרה שיטה חסכונית אופטימיזציה עבור בידוד תא צינורי ללא צורך טיהור. כאן, אנו מספקים פרוטוקול בידוד המאפשרת עבור לימודי התמקדות בשני ראשי העכבר לקרע, אקדח כליות. בנוסף ריאגנטים חסכונית מינימלית הליכים בעלי חיים נדרש ב פרוטוקול זה, התאים מבודד לשמור על רמות אנרגיה גבוהות לאחר בידוד והוא יכול להיות תת תרבותי עד ארבעה קטעים, המאפשר לימודי מתמשך. יתר על כן, אנו באמצעות מנתח תפוקה גבוהה השטף חוץ-תאית, להעריך את הנשימה מיטוכונדריאלי ישירות ב- אקדח מבודד בצלחת 96-ובכן שעבורו אנו מספקים המלצות עבור אופטימיזציה צפיפות תא וריכוז מורכבים. מקרים אלה מצביעים על כך שניתן להשתמש בפרוטוקול זה ללימודי אבובית הכליה לשעבר vivo בהפקה עקבית, היטב מתוקננת של אקדח כליות. פרוטוקול זה עשוי להיות רחב יותר יישומים עתידיים ללמוד בתפקוד מיטוכונדריאלי הקשורים עם מחלות כליות גילוי תרופות או סמים אפיון למטרות.
תפקוד תאי אפיתל אבובית הכליה (TEC) משויך בחריפות מצב הבריאות הכללית של הכליה. איתות פתולוגיים בכליה גורם dedifferentiation של אקדח, אשר ממלא תפקיד מרכזי כליות פיברוזיס ו כליות כרונית (CKD) המחלה1,2. כמו איבר מאוד אנרגטי, הכליה היא שנייה רק ללב בצריכת חמצן, בעיקר באמצעות זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי3. מיקרוסקופ אלקטרונים מחקרים גילו מתאם חיובי של שינויים מורפולוגיים מיטוכונדריאלי לאירועים פתולוגיים בקוריאנית כליות4. תפקוד מיטוכונדריאלי אקדח גורמת פיברוזיס הכליות דרך המעבר אפיתל כדי mesenchymal5 ו- חמצון חומצות שומן פגום6. פיברוזיס היא מחלה כליות מתקדמת, שתוצאתו CKD. לכן, הבנת המצב האנרגטי של אקדח כליות היא הכרח לגלות את הפתופיזיולוגיה של CKD.
ישנם סוגי תאים > 20 הכליה למבוגרים7. ללמוד את הפונקציה של אקדח, תרבות העיקרי של תאי אפיתל כליות נדרש כפלטפורמה עבור יישומים בביולוגיה מולקולרית כגון טיפולים כימיים שינויים גנטיים. חשוב, ניתן לבצע מניפולציות גנטיות ב- vivo בעכברים באמצעות transgenesis או באמצעות טכניקות מסירה ג’ין AAV8 כך התאים הראשי מבודד כבר להיות גנטית מניפולציות. בידודו של ראשי תאים הכרישים כליות עכברים9,10, חולדות11,12,13, ניבים14,15,ארנבים16, בני אדם17 ,18 דווחה בצעדים טיהור להניב טהור תאים צינורי הפרוקסימלית. בפרוטוקולים אלה שפורסמו קודם לכן להתמקד הבידוד של תאים צינורי צינתור, צנטריפוגה הדרגתיות ומיון הניסויים בוצעו עבור מטרות טיהור19. בעוד פרוטוקולים אלה הם בעלי ערך לימוד בקוריאנית צינתור, הן אינן מספיקות כאשר בקוריאנית הן לקרע, יש צורך ללמוד. לדוגמה, המחקר שלנו על תסמונת אלפורט חשף כי בקוריאנית כליות הן לקרע, תפקיד חשוב התקדמות המחלה20, לכן שני סוגי בקוריאנית כליות צריך להיחקר בתרבות. מחקר שנערך לאחרונה על רעילות פלואוריד כליות הראה גם כי שינויים פתולוגיים התקיים בשני בקוריאנית לקרע,21. לכן, פרוטוקול זה בידוד הוא עוצב באופן מיטבי עבור תאים צינורי הפרוקסימלית ו דיסטלי של העכבר הכליות בעלות מינימאלית של ריאגנטים, נהלים פשוטים. לחלופין, חוקרים יכולים עדיין לעקוב אחר הפרוטוקול עד שלב 3.1 ולהוסיף טיהור שלבים9 מעתה והלאה בידוד תאי צינורי proximal טהור.
התאים מבודד להציג רמות אנרגטיות גבוהות ולשמור על מאפייני האפיתל כליות לאחר תרבויות משנה כדי 4 מעברים. באמצעות מנתח תפוקה גבוהה השטף חוץ-תאית, נוכל להעריך את הנשימה מיטוכונדריאלי ישירות ב- אקדח מבודד בצלחת 96-ובכן, מה שמוביל תובנות נוספות לתוך התא צפיפות אופטימיזציה. מקרים אלה מצביעים על פרוטוקול זה יכול להיות מיושם ללימודים אבובית הכליה לשעבר vivo בהפקה עקבית, היטב מתוקננת של אקדח כליות. משמעות נוספת של פרוטוקול זה הוא השימוש ריאלי ככלי תפוקה גבוהה שמחוץ אפיון ביואנרגיה מיטוכונדריאלי בתאים כליות לקרע, צינורי. לכן, הוא יכול לשמש כפלטפורמה גילוי תרופות או סמים למטרות אפיון של מחלות כליות.
אנו ממוטב פרוטוקול המאפשר בידוד יעיל של העכבר כליות צינורי בתאי אפיתל (אקדח), הראה כי התאים יכולים להיות תת תרבותי עבור ניתוח השטף חוץ-תאית להעריך את הנשימה מיטוכונדריאלי בנוכחות חומצה שומן- ו/או מבוסס-גלוקוז סובסטרטים. פרוטוקול זה מיועד עבור לימודי התמקדות תאים צינורי הן לקרע, ומשמש מסגרת שבה לבנות ניסויים מורכבים יותר להבנת מחלות הקשורות הפתולוגיה הכליה טק. לעומת פרוטוקולים שפורסמו בעבר9,10,19, שיטה זו אינה דורשת הפרדות צבע עם זמן צנטריפוגה פעמים או השימוש של נוגדן בשפע למיון ומציעה, לכן, יותר מדריך יעיל אופטימיזציה עבור חוקרים הפועלים בשטח מטבולית אבובית הכליה. ישנם מספר שלבים קריטיים פרוטוקול זה, כולל עיכול, אוסף מחדש, ואת צפיפות יופיצ, מתחם למיטוב וזמינותו השטף חוץ-תאית.
בחירת סוג collagenase וריכוז אופטימלי הנכון הוא המפתח לעיכול מוצלחת, דיסוציאציה של התאים צינורי רקמות הכליה. לעומת סוגים אחרים של collagenases, collagenase מסוג 2 מכיל רמות גבוהות יחסית של פעילות פרוטאז, מסוגל בריא מבנים כליות קומפקטי. כדי לצמצם את הסיכון של זיהום כתוצאה זלוף ממושכת זמן עיכול, collagenase מסוג 2 0.013% היה perfused ב- 30 מ ל/דקה. הקפסולה כליות הוסרה רק לאחר שתי הכליות היו מן החיה והעבירו לתוך ברדס תרבות תא מעוקר. הכליות היו כתוש לחתיכות קטנות והמשיך שלהם דגירה עם 10 מ”ל של מאגר לעיכול עבור עוד 5 דקות לעיכול מלאה, שחרור מקסימלי של התאים צינורי.
למרות זאת, לאחר העיכול, ההשעיה רקמות מועברת דרך מסנן 70-מיקרומטר להסיר חתיכות רקמה גדול מאוד, עדיין יהיה מעוכל בקוריאנית זה לעבור דרך המסנן, כשנקבע התליה תא, מקבל מצופה על המנה תרבות. זה לוקח זמן רב יותר מהרגיל עבור אלה בקוריאנית לשחרר את התאים צינורי ולצרף בחוזקה לצלחת תרבות. לכן, חשוב למדי לאסוף התליה תא centrifuge כדי הצניפה בקוריאנית כעיגולים בצבע של תאים ביום השני לאחר ציפוי התא. שלב זה צנטריפוגה במהירות נמוכה יותר מסיר סוגי תאים אחרים, כי הם קלים יותר תאים צינורי ומאפשר בקוריאנית כעיגולים בצבע ותאים צינורי להתיישב.
הזיהוי של צפיפות התא הנכון הוא הצעד הראשון, מפתח עבור וזמינותו השטף חוץ-תאית מוצלחת. התוצאות הראו כי 40,000 תאים לכל טוב על microplate XF96 הינו אידיאלי עבור ראשי תאים צינורי חומצת שומן והן וזמינותו של נשימה המבוסס על גלוקוז (איור 3C). ב פרוטוקול זה, תאים בודדים צינורי שימשו את השטף חוץ-תאית assay בבית פסקאות 1 ו- 2. התאים תת תרבותי אל מעבר 3, למרות שמר על ביטוי של הסמנים צינורי (איור 2), ביצועים סבירים, מבחני ביואנרגיה (איור 3 א) והם הראו רמות נשימה הבזליים ירידה לעומת מעבר 2 (מוצג על-ידי השוואת OCR הפאנלים הימניות של איור 3A כדי דמות 3C). ירידה זו לא משפיעה על תאים צינורי בריאים באופן משמעותי (למשל, אלה מבודד עכברים צעירים פראי-סוג). אולם, ללימודים על תאים מבודד בדגמי העכבר CKD כבר של נשימה מופחתת מיטוכונדריאלי, מעברים גבוה יותר של התאים עלול לגרום לירידה נוספת נשימה הבזליים אשר ישפיע על התוצאות של וזמינותו השטף חוץ-תאית. במחקרים שנערכו כאן, התאים מעבר 1 והן מעבר 2 הראו גבוהה נשימה הבזליים רמות. לכן, בעקבות פרוטוקול זה, אנו ממליצים להשתמש אלה שתי פסקאות מוקדמות ללימודי מיטוכונדריאלי נשימה עם תאים מבודדים מבעלי חיים בריאים וחולים. תאים מן המעבר 2 צריך עדיין לקחת בחשבון אם התרבות המשנה מעבר 1 אינה נותנת מספיק תאים עבור וזמינותו השטף. בנוסף לימודי ביואנרגיה, מחקרים קודמים שלנו מראה כי ראשי אקדח-מעבר 3 יכול להיות מאוד שימושי עבור טיפולים עם תרכובות ואחריו חלבון ולימודי RNA (נתונים לא מוצג). עם זאת, אנו ממליצים חוקרים באמצעות פרוטוקול זה בידוד תאי צינורי צריך לבחור בקפידה את המעבר אופטימלית עבור יישומי מחקר שונים.
עקרון הפעולה של ניתוח השטף חוץ-תאית מבוססת על האינטראקציות בין תרכובות מוזרק ולא את מתחמי שרשרת הנשימה ואת השפעת uncoupler. Oligomycin הוא מעכב של מורכבות החמישי (ATP סינתאז) והוא משמש כדי להבחין בין צריכת החמצן מקושרים-ATP ואת צריכת החמצן הדרושה כדי להתגבר על הדליפה פרוטון רגיל על פני הממברנה הפנימית מיטוכונדריאלי32. FCCP uncouples צריכת החמצן של ייצור ATP על ידי לשבש את הקרום מיטוכונדריאלי פוטנציאליים. לפיכך, הוא מספק מידה לקיבולת מירבית נשימה כמו זה עוקף את קיבולת מוגבלת של בזרימת יון פרוטון מאת ATP סינתאז בכך שהוא מאפשר הובלה פרוטון דרך הקרום. Antimycin-A, מעכב השלישי מורכב, ולא rotenone, מתחם אני חוסם, משמשים בשילוב לסגור את הנשימה מיטוכונדריאלי כולו ומאפשר הבחנה בין מיטוכונדריאלי לעומת צריכת חמצן מיטוכונדריאלי ב התאים. תרכובות אלו צריך תמיד להיות טיטרציה עבור סוג תא מסוים לפני וזמינותו השטף חוץ-תאית לקבוע ריכוז אופטימלי המניבים את עקומות OCR אופטימלית. כאן, אנו ממליצים 1 מיקרומטר של oligomycin, 1 מיקרומטר של FCCP ו 2 מיקרומטר של rotenone/antimycin A עבור וזמינותו השטף חוץ-תאית-אקדח העיקרי.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה וחסכונית לבודד כליות העיקרי לקרע, צינורי תאים אפיתל שיכול לשמש להערכת ביואנרגיה מיטוכונדריאלי ex-vivo. בעוד פרוטוקול זה יכול להיות שימושי מגוון רחב של לימודי ביולוגיה מולקולרית לחקור את תפקוד הכליות תאי אפיתל צינורי ביולוגי, אנו להכיר מגבלותיו בעת החלתו על מחקרים הזקוקים בקוריאנית צינתור או דיסטלי טהור. לדוגמה, מחקרים על התסמונת לאו, סלקטיבי בתפקוד צינורי הפרוקסימלית של33או מחקרים על דיסטלי חמצת אבובית הכליה, תפקוד צינורי דיסטלי34, ידרוש פרוטוקול מתוחכמים יותר לבידוד תא ו טיהור. עם זאת, עבור רוב המחקרים המשווים בקוריאנית לעומת glomeruli, ללימודי למסך הרגולטורים פוטנציאל הנשימה מיטוכונדריאלי בתאים צינורי באופן כללי, הפרוטוקול מספקת גישה אפשרית תפוקה גבוהה. לכן, פרוטוקול זה ייתכן יישומים רבים ללמוד בתפקוד מיטוכונדריאלי הקשורים עם מחלות כליות למטרות אימות גילוי או היעד סמים.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים כדי שחאדה א לינה: את המכון הלאומי לבריאות (R56HL132209 ו- 1R01HL140468), מכון המחקר של הלב מיאמי.
Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |