该协议提供了一种经济高效的方法, 以分离和表征小鼠原发性肾管细胞, 随后可以进行亚培养, 以评估肾脏生物学功能, 包括线粒体生物能学。
肾小管上皮细胞线粒体功能障碍 (TECs) 可能导致肾纤维化, 这是慢性肾脏疾病 (CKD) 的主要病因。因此, 对原发性 TECs 线粒体功能的评估可以为细胞的 bioenergetic 状态提供有价值的洞察力, 提供对 CKD 病理生理学的洞察力。虽然有许多复杂的协议, 以分离和纯化的近端小管在不同的物种, 该领域缺乏一个经济有效的方法, 优化管状细胞隔离, 而不需要净化。在这里, 我们提供了一个隔离协议, 允许研究集中在主鼠近端和远端肾 TECs。除了本议定书所要求的具有成本效益的试剂和最小的动物程序外, 隔离细胞在分离后保持了较高的能量水平, 可以分培养到四通道, 允许持续研究。此外, 利用高通量胞外流量分析仪, 我们直接评估了96井板中孤立 TECs 的线粒体呼吸, 为优化细胞密度和复方浓度提供了建议。这些观察表明, 该协议可用于肾小管体外研究与一致, 标准化生产的肾脏 TECs。该协议可能有更广泛的未来应用研究与肾脏疾病相关的线粒体功能障碍的药物发现或药物表征目的。
肾小管上皮细胞 (TEC) 功能与肾脏的整体健康状况密切相关。肾脏病理信号引起 TECs 的分化, 在肾脏纤维化和慢性肾脏疾病 (CKD)1,2中起着重要作用。作为一个高度精力充沛的器官, 肾脏是仅次于心脏在氧气消耗量, 主要通过线粒体氧化磷酸化3。电镜研究显示, 肾小管4的线粒体形态学改变与病理事件呈正相关。TECs 线粒体功能障碍导致肾纤维化通过上皮间质转移5和缺陷脂肪酸氧化6。纤维化是一种渐进性肾脏病理学, 导致 CKD。因此, 了解肾脏 TECs 的能量状态是揭示 CKD 的病理生理学的必要。
有 > 20 细胞类型在成人肾脏7。为了研究 TECs 的功能, 需要将肾上皮细胞的原代培养作为分子生物学应用的平台, 如化学治疗和基因处理。重要的是, 基因操作可以通过转基因或使用 AAV 基因传递技术在小鼠体内进行 ,从而使分离的主要细胞已经被基因操纵。小鼠9,10, 大鼠11,12,13, 犬齿14, 兔15,16, 和人的原发性肾管状细胞的分离17 ,18已被报告纯化步骤, 以产生纯近端管状细胞。在这些先前发表的协议中, 聚焦于近端管状细胞的分离, 进行了梯度离心和分选实验, 用于净化目的19。虽然这些协议对研究近端小管有很高的价值, 但当需要研究近端和远端小管时, 它们是不够的。例如, 我们对 Alport 综合征的研究表明, 近端和远端肾小管在20的疾病进展中起着重要作用, 因此在培养中应研究两种肾小管。最近一项关于肾氟中毒的研究还表明, 近端和远端小管21均发生了病理改变。因此, 该隔离协议的设计和优化的近端和远端管状细胞从小鼠肾脏与最低的试剂成本和简单的程序。另外, 调查人员仍然可以遵循该协议, 直到步骤 3.1, 并添加净化步骤9从这一点前, 以隔离纯近端管状细胞。
分离细胞呈现高能量水平, 在亚文化后保持肾上皮特征为4通道。利用高通量胞外流量分析仪, 对96井板分离 TECs 中的线粒体呼吸进行直接评估, 从而进一步深入研究细胞密度优化问题。这些观察表明, 该协议可以应用于肾小管体外研究与一致, 标准化生产的肾脏 TECs。该协议的一个附加意义是它作为高通量工具在肾近端和远端管状细胞中线粒体生物能学的体外鉴定中的可行性应用。因此, 它可以作为药物发现或药物表征的目的, 为肾脏疾病的一个平台。
我们优化了一个协议, 允许有效地隔离小鼠肾脏管状上皮细胞 (TECs), 并表明细胞可以进行亚培养的细胞外通量分析, 以评估线粒体呼吸的存在脂肪酸-和/或葡萄糖基基质。本协议的目的是研究聚焦在近端和远端管状细胞, 并作为一个框架, 以建立更复杂的实验, 以了解与疾病病理相关的肾病。与以前发布的协议9、10、19相比, 此方法不需要具有长时间离心时间的渐变分离或大量的抗体使用来进行排序, 因此提供了更为肾小管代谢领域的研究人员提供高效、优化的指导。该协议有几个关键步骤, 包括消化, 再收集, 电镀密度和复合优化的细胞外通量测定。
选择正确的胶原酶类型和最佳浓度是成功消化和分离肾组织管状细胞的关键。与其他类型的胶原酶相比, 2 型胶原酶含有相对较高的蛋白酶活性, 能够游离致密的肾脏结构。为了尽量减少由于长期灌注和消化时间造成的污染的几率, 0.013% 2 型胶原酶在30毫升/分钟内灌注。肾脏胶囊只有在两个肾脏从动物身上收获并转移到一个消毒细胞培养罩后才被除去。肾脏被切成小块, 并继续他们的孵化与10毫升的消化缓冲5分钟, 完全消化和最大释放的管状细胞。
虽然, 消化后, 组织悬浮通过一个 70-µm 过滤器, 以去除非常大的组织片断, 仍然会有未消化的小管通过过滤器, 并留在细胞悬浮, 并得到镀到培养皿。这些小管要花较长的时间, 才能释放细胞, 并牢牢附着在培养皿上。因此, 在细胞电镀后的第二天, 收集细胞悬浮液和离心机对未连接的小管和细胞进行颗粒分离是相当重要的。这种低速离心步骤进一步去除比管状细胞更轻的其他细胞类型, 并允许不连接的小管细胞和管子干细胞沉淀。
正确细胞密度的鉴定是成功的细胞外通量测定的第一步和关键步骤。结果表明, XF96 微板块上的4万个细胞在脂肪酸和葡萄糖基呼吸试验中都是理想的原发性管状细胞 (图 3C)。在本协议中, 分离的管状细胞用于1和2通道的胞外通量测定。细胞亚培养到通过 3, 虽然他们保持了管状标记的表示 (图 2) 和一个体面的表现在生物能学化验 (图 3A), 并且显示了基本的呼吸水平减少了与段落2相比(通过将图 3A最右边的面板中的 OCR 与图 3C进行比较来显示)。这种减少可能不会影响实质上健康的管状细胞 (例如, 孤立于年轻的野生型小鼠)。然而, 对于已经减少了线粒体呼吸的 CKD 小鼠模型进行的研究, 更高的细胞通道可能导致基础呼吸的进一步下降, 这将影响细胞外通量测定的结果。在这里进行的研究中, 1 和2段的细胞都显示出高的基底呼吸水平。因此, 遵循这一协议, 我们建议使用这两个早期通道的线粒体呼吸研究与细胞分离的健康和患病的动物。如果通过1次亚文化不产生足够的细胞进行通量测定, 则2通道中的细胞仍应考虑在内。除了生物能学的研究, 我们以前的研究表明, 在3通道的初级 TECs 可以非常有用的治疗后, 蛋白质和 RNA 研究 (数据没有显示)。这样说, 我们建议使用此协议隔离管状细胞的研究者应该仔细选择不同研究应用的最佳通道。
细胞外通量分析的工作原理是基于注入化合物与呼吸链复合物的相互作用以及 uncoupler 的作用。寡霉素是一种复合 V (atp 合酶) 抑制剂, 用于区分 ATP 连接的氧气消耗和氧消耗, 以克服线粒体内膜32中的常规质子泄漏。FCCP uncouples 氧消耗从 ATP 生产通过扰乱线粒体膜电位。因此, 它提供了一个测量最大的呼吸能力, 因为它绕过了有限的能力, 质子离子外流的 ATP 合成酶通过允许质子传输通过膜。Antimycin, 一个复杂的 III 抑制剂, 和鱼藤酮, 一个复杂的 I 阻滞剂, 被用来组合关闭整个线粒体呼吸允许分化之间的线粒体与非线粒体氧消耗的细胞。在细胞外通量测定前, 这些化合物应始终滴定特定细胞类型, 以确定最佳的 OCR 曲线的最优浓度。在这里, 我们建议1µM 的寡霉素, 1 µM 的 FCCP, 2 µM 的鱼藤酮/antimycin A 的细胞外通量测定的主要 TECs。
总之, 该协议提供了一种简单和经济有效的方法, 以隔离肾原体近端和远端管状上皮细胞, 可用于评估线粒体生物能学的体外。虽然本议定书可以在广泛的分子生物学研究中发挥作用, 探讨肾小管上皮细胞的生物学功能, 但我们承认它的局限性, 当它应用于需要单纯的近端或远端小管的研究。例如, 研究罗氏综合征, 选择性近端管状功能障碍33, 或研究远端肾小管性酸中毒, 远端管功能障碍34, 将需要一个更复杂的协议, 细胞隔离和净化。然而, 对于比较小管与肾小球的大多数研究, 以及对于筛查一般细胞中潜在的线粒体呼吸调节器的研究, 该协议提供了一种可行的高通量方法。因此, 本议定书可能有广泛的应用研究与肾脏疾病相关的线粒体功能障碍的药物发现或目标验证目的。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到以下赠款的支持: Shehadeh (R56HL132209 和 1R01HL140468) 和迈阿密心脏研究所。
Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |