여기 우리는 초보자에 대 한 프로토콜 Streptomyces약리학 중요 한 세균 속에 대 한 형질을 시작 하는 연구원을 제시.
Streptomycetes는 세계에 걸쳐 발견 되 고 광범위 한 항생제 및 다른 이차 대사 산물을 생산 하는 문 Actinobacteria에 속하는 filamentous 토양 박테리아. Streptomyces coelicolor 는 다양 한 실험실 분석에 순종을 잘 특징, 비 병원 성 종입니다. 설명 하는 형질 방법을 여기 모델 streptomycete; S. coelicolor 사용 그러나, 방법 몇 가지 밀접 하 게 관련 된 actinomycetes로 서이 큰 속의 모든 구성원에 적용 됩니다. 형질 Streptomyces 환경에서 확인 된의 새로운 종 특성화 하는 데 필요한 이며 또한 특성화 Streptomyces의 새로 고립 된 돌연변이 체 긴장에 중요 한 첫 번째 단계입니다. 형질에 능력 세균 개발, 세포 분열, 염색체 분리 및 두번째 메신저 신호 연구 포함 Streptomyces 연구 분야를 입력 하는 많은 새로운 연구자에 대 한 중요 하다. 새로운 토양 미생물의 격리를 통해 항생제 발견의 최근 crowdsourcing 학생 훈련 강사 Streptomyces 연구와 그들의 대학 또는 고 등의 분야에 새로운에 대 한 형질에 대 한 증가 필요에 결과 있다. 이 원고는 세균성 긴장 전파, 저장, 및 영상 및 현미경 검사를 통해 특성화에 대 한 방법을 설명합니다. 이 기사를 읽은 후 새로운 연구원 (미생물학 교육 연구소와 시민 과학자) Streptomyces 긴장을 조작 하 여 시각적 특성 실험을 시작 수 있어야 합니다.
Streptomycetes은 그람 양성, filamentous 토양 박테리아 항 HIV 및 안티 기생 약물 다양 한 상용 항생제 뿐만으로 안티 종양의 2/3 이상을 포함 하 여 2 차 대사 산물을 생산 하는 능력에 대 한 알려진 1. S. coelicolor 속2,3 의 가장 유전자 특징이 회원 이며 여기에 설명 된 방법을 사용 하는 종족 이다. S. coelicolor 는 한 천 매체에 성장 하는 광범위 한, 분기 식물 사체가 진행 단일 포자의 발 아로 시작 하는 복잡 한 수명 주기 있다. 라이프 사이클 진행, 공중 필 라 멘 트 기판 균 사체의 표면 장력을 깰 하 고 마침내 성숙, 회색 착 포자로 궁극적으로 변환 되는 셀의 긴 체인으로 나누어집니다 형성 된다. 이 새로 형성된 된 포자의 분산 다음 라이프 사이클4의 시작 부분을 구성합니다.
차별화의 복잡 한 패턴, 때문에 S. coelicolor 세균 개발의 연구에 대 한 우수한 모델 역할을 합니다. 역사적으로, 돌연변이 블록 개발의 두 가지 주요 단계에 대 한 고 독특한 시각적 고기를 생산. 빌딩 (대머리) 돌연변이 공중 사체가 형성 및 퍼지 공중 균 “대머리” 식민지 모양을 부여의 부족에서 결과 대 한 차단 됩니다. 돌연변이 포자 형성에 저해 하 고 성숙 이라고 합니다 whi (흰색) 돌연변이 때문에 그들은 일반적으로 야생-타입 수준의 회색 포자 안료의 생산에 실패 하 고 공중 균 남아 흰색. 다른 흥미로운 돌연변이 항생제 생산, 세포 분열, 염색체 분리, 또는 다른 중요 한 프로세스4,5에 저해 된다.
Streptomyces 종에 많은 발달 유전자의 발견에도 불구 하 고 많은 더으로 존재 돌연변이 스크린의 채도의 부족에 따라 있다. 우리의 실험실 우리가 건설 미니 transposon 시스템을 사용 하 여 새로운 발달 유전자 확인 계속. 소설 돌연변이 체 긴장 우리의 transposon 임의의 mutagenesis 실험에서 고립 된 각 새로운 유전자 발견6,7의 가능한 역할을 식별 하는 phenotypic 심사를 받 다. 여기서 설명 하는 세균성 형질에 대 한 메서드는 transposon mutagenesis8,,910,11,12,에 의해 절연 Streptomyces 돌연변이 관련이 13 및 recombineering15,16 를 사용 하 여 유전자 삭제 같은 돌연변이의 감독된 건설 뿐만 아니라 화학 및 자외선 (UV) mutagenesis14, 임의의 다른 방법 또는 CRISPR-Cas9 (클러스터 정기적으로 Interspaced 짧은 구조 반복) 게놈 기술17,,1819 와 점 돌연변이20편집.
항생제 내성 병원 균 중에서 점점 더 널리 되 고, 새로운 항생제에 대 한 필요성은 점점 긴급21,22. “” 작은 세계 이니셔티브 (SWI) 효과적인 과학, 기술, 공학 및 수학 (줄기) 학습 이다 대학생, 등의 crowdsourcing 통해 항생제 저항에 대처 하기 위해23 및 연구 전략24 최근 고 등 학생입니다. 작업 포함 소설 항생제 (http://www.smallworldinitiative.org)을 생성 하는 새로운 토양 미생물을 식별 하는 과정을 지원 합니다. 그것은 알려지지 않은 항생제의 주요 원천이 Streptomyces 종 토양의 넓은 범위에서 발견 하 고 물 서식 지25,26,,2728, 계속 믿고 29,31. 최근, 우리의 실험실과 다른 사람의 작품 발견 하 고 형태학 및 개발, 항생제 생산7,32, Streptomyces 종 신호 유전자 특징 33. 이 유전자의 표정에 변화 양과 항생제 생산의 타이밍에 있는 변화 귀 착될. 새로운 종 및 새로운 항생제 생산 돌연변이의 숙련 된 형질 중요 한 것을 계속할 것 이다. 새로운 강사와 학생 들이 될 신약 분야의 주요 참여자, 박테리아 형질에 훈련은 이러한 초보자 개인의 성공을 위해 필요 합니다. 또한,이 실험은 고등학교 줄기 또는 대학 미생물학 교육 실험실에 대 한 세공. 그들은 가르치는 실험실 설정에서 기본 미생물 유전 원리의 데모를 나타냅니다.
여기 선물이 Streptomyces 연구원 종자를 전파 하 고 장기 저장을 위한 주식을 준비 하는 데 필요한 단계를 포함 하 여 연구를 시작 하려면 시작을 위한 프로토콜. 우리는 다음 Streptomyces 긴장의 영상 및 현미경 특성에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 형질 발달 돌연변이 몇 가지 전형적인 초기 단계: 1) 한 천 매체;에 야생 유형 식민지에 비해 돌연변이 식민지의 시각적인 검사 2) 단계 대조 현미경 검사 법; 그리고 3) sporogenic 공중 균의 형광 현미경 검사 법. 이 세 단계에 표시 된 표현 형을 바탕으로, 다양 한 기술 더 분별 특정 긴장의 표현 형을 채택 될지도 모른다.
초기 형질 실험 새로운 종족의 특성, 식별 하 관심의 돌연변이, 부분적으로 돌연변이, 특성화 고는 확인 된 돌연변이의 표현 형에 따라 특정 유전자의 일반적인 역할을 분별 하기 시작 일반적으로 사용 됩니다. 여기에 설명 된 방법은 식별 하 고 특성 Streptomyces 돌연변이, 세포 분열48,49, 에 그 결함을 포함 한 광범위 한 실험실을 교육 하는 대학에 이미 사용 되었습니다. 50 , 51 , 52 , 53 , 54, 포자 형성55,56, 공중 사체가 형성57,58, 항생제 생산59, 두번째 메신저 신호47및 염색체 분리 60. 이러한 일반적인 돌연변이의 표현 형을 결정 하는 중요 한 첫 번째 단계는 기술과 많은 양의 관심사의 유전자의 역할에 대 한 중요 한 정보를 공개. 방법은 Streptomyces 의 다른 종에 쉽게 확장 될 수 있습니다 그리고 이미 긴장의 S. griseus, S. venezuelae, S. 옴, 다른 많은 streptomycetes를 설명 하기 위해 사용 되었습니다. 여기서 설명 하는 비디오 프로토콜은 약물 발견의 지역에서와 같은 Streptomyces 연구의 분야를 입력 하는 새로운 연구를 위한 중요 한 자원으로 봉사 예상 된다. 항생제 저항 위기와 교육의 작은 세계 이니셔티브 crowdsourcing 노력에 합류 새로운 학부 학생 연구원의 무수 한 숫자에 대처 하기 위해 노력 하 고 새로운 교원 포함 됩니다.
여기에 설명 된 기술 연구 실험실, 비디오 및 텍스트에 설명 된 수정을 사용 하 여 뿐만 아니라 대학 및 고등학교 교실 사용을 쉽게 적용할 수 있습니다. 학생 들은 작은 교양 과목 대학에서 첫 해 현미경 모듈에 긴장을 행진, 한 천 매체에 성장 긴장의 디지털 사진을 수행의 제출에 최고봉 단계 대조 및 형광 현미경을 수 있었다는 실험실에서 작업의 15 h 대표 3 주 모듈의 끝에 멀티 패널된 그림의 포트폴리오. 약 160 첫 해 학생 320 소설 transposon 돌연변이의 초기 형질에 대 한 책임 했다. 3 교육 기관에서 학부 연구 생 추가 돌연변이의 초기 형질 및 긴장의 많은 것의 후속 특성화에 참가 했다. 상대적으로 짧은 기간에 얻은 포괄적인 데이터 여기에 설명 된 프로토콜의 값을 보여 줍니다. 수백 추가적인 돌연변이 미래 특성화에 대 한 글리세롤 바로 주식으로 저장 되어 있다.
여기서 설명 하는 초기 실험에 따라 방법의 다양 한 관심의 계통에 관한 정보의 품질을 확장 하 채택 될지도 모른다. 돌연변이 알 수 없는 경우 유전형 메서드 타입이 돌연변이의 위치를 결정 하기 위해 고용 해야 합니다. 예를 들어 임의의 transposon mutagenesis 야생-타입 염색체6,7,,89,10,11,12,13 초기 phenotypic 화면 그 설명 등 위의 받아야 한다 식민지에 있는 결과. 다음 위치는 transposon의 역 중 합 효소 연쇄 반응 (iPCR)61같은 기술을 사용 하 여 식별 되어야 합니다. 새로 발견된 된 돌연변이의 유전자 형 결정 초기 특성을 다음 중요 한 단계입니다.
교실에서 언급 되거나 추가 연구를 통해 탐험 수 있는 후속 형질 분석에 대 한 몇 가지 일반적으로 사용 되 고급 방법이 포함 녹색 형광 단백질 (GFP), 관심사의 단백질에 대 한 지역화 패턴을 확인 하려면 태그 진짜 같은 유전자 표정 분석 시간 정량 PCR (정량) 및 야생-타입의 글로벌 유전자 표현 패턴 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)를 통해 돌연변이 대. 형질 실력은 또한 유전 보완성 분석을 위해 필요 합니다. 보완성 실험에서 야생-타입 유전자 사본의 새로 추가 된 대립 유전자의 손실 돌연변이 대립 유전자의 기능에 대 한 보상 수 있습니다 여부를 결정 하는 돌연변이 스트레인에 소개 된다. 원래 돌연변이는 부모 모두의 보충된 긴장의 표현 형 비교, 야생-타입 스트레인이 필요 합니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 Otterbein 대학 학부 학생 연구 장학금 및 학생 연구 기금 상 SGK; GVK을 인정 하 고 싶습니다. Otterbein 교수 길버트 E. 밀스 기념 식 프로그램 상을 부여 하 고 학과의 생물학 및 지구 과학 교수 연구와 장학금 부여 잽을 수상. 버트와 제인 경적 부여 학생 연구 기금 과학에서 SGK GVK를 수 여 되었다. 저자 또한 기꺼이 인정 뒤 케 인 대학 GVK 및 SGK 학부 연구 장학 프로그램을 투자 하 고 싶습니다. 전 Juniata 대학 학부 연구 생, 라이언 존슨과 린지 드레이퍼 공헌 했다 현미경 이미지 그림 2 및 3, 각각.
50% Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Immersion Oil (Type DF) | Cragille | 16482 | |
Lens Paper | Fisherbrand | 11-995 | |
Sterile Water | GeneMate | G-3250-1L | |
100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
Toothpicks (flat) | Target | 081-22-1957 | |
Pipette Tips (10 ml) | GeneMate | P-1240-10 | |
Pipette Tips (200 ml) | GeneMate | P-1240-200Y | |
Pipette Tips (1250 ml) | GeneMate | P-1240-1250 | |
Wooden Applicators 6'' | Solon Care | 070809 | |
Cotton Swabs | Fisherbrand | 23-400-124 | |
Soy Flour | Bob's Red Mill | 1516C164 | |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-1KG | |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
Glycerol 100% | VWR amresco life science | 0854-1L | |
0.8% NaCl (Saline) | Sigma-Aldrich | SLBB9000V | |
1.2 mL freezer tube | NEST | 606101 | |
Ultra low (-80°C) freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Cryo Safety Gloves | Bel-Art | H13201 | |
Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5856-500EA | |
Cover slips #1.5 | Thomas Scientific | 64-0721 | |
Slides | Carolina | 63-2010 | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540E | |
Phase-Contrast Microscope | Olympus | BX40 | |
Forceps | Carolina Biological | 624504 | |
Bunsen Burner | Carolina Biological | 706706 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
PBS (phosphate buffer saline) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
WGA-FITC | Biotium | 29022-1 | |
Clear nail polish | OPI | 22001009000 | |
Image J | NIH | Free Software | |
100 mL beaker | Pyrex USA | 1000-T | |
1 L beaker | Carolina Biological | 721253 | |
1 L flask | Fisherbrand | S63274 | |
250 mL flask | Pyrex USA | 4980 | |
100 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721788 | |
500 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721792 | |
Stir Bar | Fisher Scientific | 22-271825 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Camera for Microscope | Olympus | DP72 | |
Nitrile Examination Gloves (Med) | Bio Excell | 71011002 | |
Vortex Mixer | Carolina Biological | 701077 |