在这里, 我们提出了新手研究员的协议, 以启动分型药理重要的细菌属链霉菌。
Streptomycetes 是一种丝状的土壤细菌, 属于在世界各地发现的放线菌, 并产生广泛的抗生素和其他次生代谢物。天蓝色链霉菌是一种特性良好的非致病性物种, 可以在实验室进行各种分析。这里描述的分型方法使用天蓝色作为模型链霉菌;然而, 这些方法适用于这一大属的所有成员以及一些紧密相关的放线菌。分型是有必要的特征的新的物种链霉菌确定在环境中, 它也是一个重要的第一步, 以表征新的分离突变株的链霉菌。熟练掌握分型对于进入链霉菌研究领域的许多新研究者来说是很重要的, 其中包括细菌发育、细胞分裂、染色体分离和第二信使信号的研究。最近, 通过隔离新的土壤微生物来进行抗生素发现的众包, 使得在分型的培训更需要为新的链霉菌研究领域的讲师和他们的学院或高中生。本手稿通过目视和显微检查来描述细菌菌种的传播、贮存和表征方法。阅读这篇文章后, 新的研究人员 (微生物学教育实验室和公民科学家) 应该能够操纵链霉菌菌株和开始视觉表征实验。
Streptomycetes 是革兰阳性, 丝状的土壤细菌, 他们的能力生产各种次生代谢产物, 包括超过2/3 的商用抗生素, 以及抗肿瘤, 抗 HIV, 抗寄生虫药1.天蓝色是2、3属最具基因特征的成员, 是此处描述的方法中使用的物种。天蓝色有一个复杂的生命周期, 始于单一孢子的萌发, 进展为一个广泛的, 分支植物菌丝生长成琼脂培养基。随着生命周期的推移, 形成了空气花丝, 打破基体菌丝的表面张力, 最终被分为长链的细胞, 最终转化为成熟的, 灰色色素孢子。这些新形成的孢子的分散构成了下一个生命周期4的开始。
由于其复杂的分化模式,天蓝色是研究细菌发育的优良模型。历史上, 突变导致两个主要发展阶段的区块, 并产生不同的视觉表型。栋(秃头) 突变体被阻塞为空中菌丝形成, 并导致缺乏一个模糊的空气菌丝传授一个 “秃” 殖民地的外观。突变体在孢子形成和成熟过程中受到抑制 , 被称为白度突变体, 因为它们通常不能产生野生类型的灰孢子色素, 而空中菌丝保持白色。其他有趣的突变体在抗生素生产, 细胞分裂, 染色体分离, 或其他重要过程中被抑制4,5。
尽管在链霉菌物种中发现了许多发育基因, 但根据突变筛的缺乏饱和度, 还有许多人认为存在。我们的实验室继续使用我们构建的微型座子系统来识别新的发育基因。在随机诱变实验中分离出的突变菌株与我们的座子进行表型筛选, 以确定每个新基因的可能作用发现6,7。这里描述的细菌分型方法与座子突变8、9、10、11、12分离的链霉菌突变体有关, 13和其他随机方法, 如化学和紫外线 (UV) 诱变14, 以及定向构造突变, 如基因删除使用重组工程15,16或CRISPR-Cas9 (聚集定期 Interspaced 短回文重复) 基因组编辑技术17,18,19和点突变20。
随着病原体耐药性的日益普遍, 对新抗生素的需求变得越来越紧迫,21,22。”小世界倡议” (或) 是一项有效的科学、技术、工程和数学 (茎) 学习23和研究策略24 , 通过大学生的众包来对抗抗生素抗药性, 以及更多最近高中的学生。支持的课程工作包括确定新的土壤微生物, 产生新型抗生素 (http://www.smallworldinitiative.org)。据信, 一个主要来源的未发现的抗生素将继续是链霉菌物种在广泛的土壤和水生境25,26,27,28, 29,31。最近, 我们的实验室和其他人的工作已经发现和特征的信号基因的链霉菌物种, 调节形态学和发展, 包括抗生素生产7,32, 33。这些基因表达的变化导致了抗生素数量和时间的变化。新物种的熟练分型和新的抗生素产生突变体将继续是重要的。随着新教师和学生成为药物发现领域的主要贡献者, 细菌分型的训练对于这些新手的成功是必要的。此外, 这些实验是适合于高中茎或大学微生物学教育实验室。它们代表了教学实验室环境中基本微生物遗传原理的演示。
在这里, 我们提出了启动链霉菌研究人员的协议, 通过包括传播菌株和准备储存长期储存所需的步骤来开始研究。然后我们描述了链霉菌菌株的视觉和显微特征的协议。分型发育突变体的一些典型初始步骤为: 1) 与琼脂培养基上野生型菌落相比的突变体的目视检查;2) 相衬显微镜;3) sporogenic 空气菌丝的荧光显微学。根据这三个步骤显示的表型, 可以使用多种技术进一步辨别特定菌株的表型。
最初的分型实验通常被用来表征新物种, 识别感兴趣的突变体, 部分地表征变种人, 并开始辨别某一特定基因的典型作用, 其基础是确定的突变体的表型。这里描述的方法已经被用于大学教学实验室, 以识别和表征各种各样的链霉菌突变体, 包括那些有缺陷的细胞分裂48,49,50,51,52,53,54, 孢子55,56, 空中菌丝形成57,58, 抗生素生产59, 第二信使信号47, 和染色体分离60. 这些技术是确定突变体的一般表型的重要第一步, 它揭示了有关基因的作用的大量重要信息。这些方法很容易推广到其他种类的链霉菌, 已经被用来描述灰色、 venezuelae、疥疮和许多其他 streptomycetes 的菌株。这里描述的视频协议有望成为新研究人员进入链霉菌研究领域的重要资源, 例如在药物发现领域。这包括新的导师, 他们正在努力抗击抗菌素耐药性危机, 并教育了无数的新本科生研究员加入了世界范围内的小全球倡议的努力。
这里描述的技术可以很容易地适应大学和高中课堂使用, 除了研究实验室, 使用的修改在视频和文本。在一所小型文科学院的第一年显微镜模块的学生能够条纹菌株, 拍摄在琼脂培养基上生长的菌株的数码照片, 并执行相对比和荧光显微镜, 这最终在提交一个在3周模块结束时, 多镶板数字的组合, 代表实验室工作的15小时。大约160个第一年学生负责最初的分型320个新的座子变种人。在三个机构的本科生研究学生参加了分型的新变种人的初始化, 以及随后的许多菌株的鉴定。在相对较短的时间内获得的综合数据, 说明了此处描述的协议的价值。数以百计的变种人被储存作为甘油菌丝的股票, 以供未来的表征。
在这里描述的初步实验之后, 可以使用多种方法来扩展与感兴趣菌株相关的信息的质量。如果突变是未知的, 应使用基因分型方法来确定突变的类型和/或位置。例如, 随机座子突变的野生型染色体6,7,8,9,10,11,12,13结果在殖民地, 应该经历最初的表型屏幕, 如上文所述。然后, 座子的位置应该使用一种技术, 如逆聚合酶链反应 (iPCR)61。确定新发现突变体的基因型是继初步鉴定后的重要步骤。
一些常用的先进方法, 随后的分型分析, 可能会在课堂上提到或通过进一步的研究, 包括绿色荧光蛋白 (GFP) 标记, 以确定的蛋白质的本地化模式的兴趣,基因表达分析, 如实时定量 PCR (qPCR) 和全球基因表达模式的野生型与突变通过 rna 排序 (rna 序列)。基因互补分析也需要分型技能。在互补实验中, 将基因的野生型拷贝引入变异菌株中, 以确定新添加的等位基因是否能补偿突变等位基因的功能损失。将补充菌株的表型与原突变体和亲本的表现形式进行比较, 需要野生型菌株。
The authors have nothing to disclose.
作者要向 GVK 和 SGK 承认 Otterbein 大学本科生研究奖学金和学生研究基金奖;和 Otterbein 教授吉尔伯特 e. 米尔斯纪念馆颁发的休假项目奖和生物和地球科学学院的研究和奖学金授予的奖励。伯特和简角赋予学生研究基金在科学被授予 GVK 和 SGK。作者还要感激地感谢 GVK 和 SGK 大学资助的本科研究项目奖学金。前 Juniata 大学本科生, 瑞安约翰逊和林赛德雷柏分别贡献了图2和3的显微图像。
50% Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Immersion Oil (Type DF) | Cragille | 16482 | |
Lens Paper | Fisherbrand | 11-995 | |
Sterile Water | GeneMate | G-3250-1L | |
100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
Toothpicks (flat) | Target | 081-22-1957 | |
Pipette Tips (10 ml) | GeneMate | P-1240-10 | |
Pipette Tips (200 ml) | GeneMate | P-1240-200Y | |
Pipette Tips (1250 ml) | GeneMate | P-1240-1250 | |
Wooden Applicators 6'' | Solon Care | 070809 | |
Cotton Swabs | Fisherbrand | 23-400-124 | |
Soy Flour | Bob's Red Mill | 1516C164 | |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-1KG | |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
Glycerol 100% | VWR amresco life science | 0854-1L | |
0.8% NaCl (Saline) | Sigma-Aldrich | SLBB9000V | |
1.2 mL freezer tube | NEST | 606101 | |
Ultra low (-80°C) freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Cryo Safety Gloves | Bel-Art | H13201 | |
Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5856-500EA | |
Cover slips #1.5 | Thomas Scientific | 64-0721 | |
Slides | Carolina | 63-2010 | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540E | |
Phase-Contrast Microscope | Olympus | BX40 | |
Forceps | Carolina Biological | 624504 | |
Bunsen Burner | Carolina Biological | 706706 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
PBS (phosphate buffer saline) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
WGA-FITC | Biotium | 29022-1 | |
Clear nail polish | OPI | 22001009000 | |
Image J | NIH | Free Software | |
100 mL beaker | Pyrex USA | 1000-T | |
1 L beaker | Carolina Biological | 721253 | |
1 L flask | Fisherbrand | S63274 | |
250 mL flask | Pyrex USA | 4980 | |
100 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721788 | |
500 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721792 | |
Stir Bar | Fisher Scientific | 22-271825 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Camera for Microscope | Olympus | DP72 | |
Nitrile Examination Gloves (Med) | Bio Excell | 71011002 | |
Vortex Mixer | Carolina Biological | 701077 |