Hier presenteren we protocollen voor beginnende onderzoekers om te starten fenotypering voor het farmacologisch belangrijke bacteriële genus Streptomyces.
Streptomyceten zijn draadvormige bodem bacteriën behorend tot het phylum Straalzwammen die zijn gevonden over de hele wereld en produceren een breed scala van antibiotica en andere secundaire metabolieten. Streptomyces coelicolor is een goed gekarakteriseerd, niet-pathogene soorten die is vatbaar voor allerlei analyses in het lab. De fenotypering methoden beschreven hier maken gebruik van S. coelicolor als een model streptomycete; de methoden zijn echter voor alle leden van dit geslacht, evenals sommige nauw verwante Actinomyceten. Fenotypering moet karakteriseren van nieuwe soorten Streptomyces geïdentificeerd in het milieu, en het is ook een belangrijke eerste stap in karakterisering van nieuwe geïsoleerde gemuteerde stammen van Streptomyces. Vaardigheid in fenotypering is belangrijk voor de vele nieuwe onderzoekers die komen op het gebied van Streptomyces onderzoek, waarin de studie van bacteriële ontwikkeling, celdeling, chromosoom segregatie en tweede messenger signalering. De recente crowdsourcing antibiotica ontdekkingstocht door het isolement van de nieuwe bodem-microben heeft geleid tot een toegenomen behoefte aan opleiding in fenotypering voor instructeurs nieuwe op het gebied van Streptomyces onderzoek en hun hogeschool of middelbare school studenten. Dit manuscript worden methoden beschreven voor bacteriële stam verspreiding, opslag en karakterisatie door middel van visuele en microscopisch onderzoek. Na het lezen van dit artikel, moet de nieuwe onderzoekers (Microbiologie Onderwijs laboratoria en burger wetenschappers) kunnen manipuleren van Streptomyces stammen en visuele karakterisering experimenten beginnen.
Streptomyceten zijn gram-positieve bacteriën, draadvormige bodem bacteriën bekend om hun vermogen om te produceren een aantal secundaire metabolieten, met inbegrip van meer dan tweederde van de verkrijgbare antibiotica, zo goed als anti-tumor, anti-HIV-virus en anti-parasitaire drugs 1. S. coelicolor is het meest genetisch gekarakteriseerd lid van het geslacht2,3 en is van de soort gebruikt in de hier beschreven methoden. S. coelicolor heeft een complexe levenscyclus, die begint met de ontkieming van een enkele spore, tot een uitgebreide, vertakkende vegetatieve mycelium die groeit uit tot het medium van de agar. Aangezien de levenscyclus te werk gaat, zijn luchtfoto door samensmelting van filamenten die breken de oppervlaktespanning van het substraat mycelium en ten slotte zijn onderverdeeld in lange ketens van cellen die uiteindelijk in volwassen, grijs-gepigmenteerde sporen omgezet zijn gevormd. Verspreiding van deze nieuw gevormde sporen vormt het begin van de volgende levenscyclus4.
Vanwege het complexe patroon van differentiatie dient S. coelicolor als een uitstekend model voor de studie van bacteriële ontwikkeling. Historisch, mutaties resulteren in blokken voor twee grote stadia van ontwikkeling en produceren verschillende visuele fenotypen. De (kale) mutants bld worden geblokkeerd voor luchtfoto mycelium vorming en het ontbreken van een fuzzy luchtfoto mycelium meegeven van een “kale” kolonie uiterlijk geven. Mutanten in spore vorming geremd en rijping worden aangeduid als whi (wit) mutanten omdat ze meestal niet produceren wild-achtige velden van het grijze spore pigment en de antenne mycelium blijft wit. Andere interessante mutanten zijn geremd in antibiotica productie, celdeling, chromosoom segregatie of andere belangrijke processen4,5.
Ondanks de ontdekking van vele developmental genen in Streptomyces -soorten zijn er veel meer geloofde bestaan op basis van het gebrek aan verzadiging van mutant schermen. Onze laboratoria blijven om nieuwe ontwikkelings genen met behulp van een mini transposon-systeem dat we hebben opgebouwd te identificeren. Roman gemuteerde stammen geïsoleerd in willekeurige mutagenese experimenten met onze transposon ondergaan fenotypische screening om te identificeren van de mogelijke rol van elke nieuwe gen ontdekt6,7. De methoden voor bacteriële fenotypering beschreven hier zijn relevant voor Streptomyces mutanten geïsoleerd door transposon mutagenese8,9,10,11,12, 13 en andere willekeurige methoden, zoals chemische en ultra violet (UV) mutagenese14, evenals de gestuurde bouw van mutaties als gene standaardknop te definiëren met behulp van recombineering15,16 of CRISPR-Cas9 (geclusterd regelmatig Interspaced korte palindromische herhaalt) genoom technologie17,18,19 en puntmutaties20bewerken.
Antibiotica-resistentie bij ziekteverwekkers naarmate steeds meer voorkomende, wordt de behoefte aan nieuwe antibiotica steeds urgenter21,22. De “Kleine wereld-initiatief” (of SWI) is een effectieve wetenschap, technologie, techniek en wiskunde (STEM) leren23 en onderzoek strategie24 ter bestrijding van resistentie tegen antibiotica via de crowdsourcing van studenten, en meer onlangs middelbare scholieren. Ondersteund cursussen werk omvat het identificeren van nieuwe bodem-microben die produceren van nieuwe antibiotica (http://www.smallworldinitiative.org). Het is van mening dat een belangrijke bron van onontdekte antibiotica blijven zal Streptomyces -soorten gevonden in een brede waaier van bodem en water habitats25,26,27,28, 29,31. Onlangs, ons laboratorium en het werk van anderen hebben ontdekt en gekenmerkt signalering genen in Streptomyces -soorten die regelen morfologie en ontwikkeling, met inbegrip van antibiotica productie7,32, 33. Veranderingen in de expressie van genen die deze resulteren in een verandering in de hoeveelheid en de timing van antibiotica geproduceerd. Geschoolde fenotypering van nieuwe soorten en nieuwe antibioticum-producerende mutanten blijft belangrijk. Naarmate nieuwe instructeurs en hun leerlingen belangrijke leverden op het gebied van Geneesmiddelenontwikkeling, is opleiding in bacteriële fenotypering noodzakelijk voor het welslagen van deze beginnende individuen. Bovendien zijn deze experimenten hanteerbare voor middelbare school stam of universiteit microbiologie onderwijs laboratoria. Zij vertegenwoordigen een demonstratie van microbiële genetische basisprincipes van een onderwijs-lab instellen.
Hier presenteren we protocollen voor beginnende Streptomyces onderzoekers om uit te voeren studies door de benodigde stappen voor het uitdragen van stammen en voorbereiding van voorraden voor langdurige opslag. Vervolgens beschrijven we de protocollen voor visuele en microscopische karakterisering van Streptomyces stammen. Enkele typische eerste stappen in fenotypering developmental mutanten zijn: 1) visueel onderzoek van de mutant kolonies in vergelijking met wild type kolonies op de drager van de agar; 2) fase contrast microscopie; en 3) fluorescentie microscopie van sporogenic luchtfoto schimmeldraden. Gebaseerd op het fenotype weergegeven in deze drie stappen, kan een verscheidenheid van technieken worden gebruikt om te verder onderscheiden het fenotype van een bepaalde spanning.
Eerste fenotypering experimenten worden gewoonlijk gebruikt om te karakteriseren van nieuwe soorten, het identificeren van mutanten van belang gedeeltelijk karakteriseren van mutanten en beginnen te onderscheiden van de typische rol van een bepaald gen op basis van het fenotype van een geïdentificeerde mutant. Al zijn de hier beschreven methoden gebruikt in het universitair onderwijs laboratoria te identificeren en te karakteriseren van een grote verscheidenheid van Streptomyces mutanten, met inbegrip van die met gebreken in celdeling48,49, 50 , 51 , 52 , 53 , 54, sporevorming55,56, luchtfoto mycelium vorming57,58, antibiotica productie59, tweede boodschapper signalering47en chromosoom segregatie 60. deze technieken zijn de essentiële eerste stappen om het bepalen van het fenotype van mutanten in het algemeen en het onthullen van een grote hoeveelheid belangrijke informatie over de functies van genen van belang. Het kan gemakkelijk worden uitgebreid tot andere soorten van Streptomyces methodenen al zijn gebruikt om te beschrijven van stammen van S. griseus, S. venezuelae, S. schurften vele andere Streptomyceten. De video protocollen die hier beschreven worden verwacht om te dienen als een belangrijke bron voor nieuwe onderzoekers invoeren van Streptomyces onderzoeksgebieden, zoals op het gebied van Geneesmiddelenontwikkeling. Het gaat hierbij om de nieuwe instructeurs die werken aan de bestrijding van de crisis van de resistentie tegen antibiotica en opleiden van de talloze aantallen nieuwe undergraduate student onderzoekers toetreden tot de inspanningen van crowdsourcing van de kleine wereld-initiatief.
De hier beschreven technieken kunnen gemakkelijk aangepast worden aan college en high school gebruik in de klas naast onderzoekslaboratoria, met behulp van de wijzigingen beschreven in de video en tekst. Studenten in een eerste jaar microscopie module op een kleine liberal arts college konden strijk stammen, digitale foto’s nemen van stammen geteeld op agarmedia, en het uitvoeren van fase-contrast en fluorescentie microscopie, wat in de indiening van uitmondde een portfolio van meerdere panelen cijfers aan het einde van de module 3 week, 15 h-lab werk vertegenwoordigen. Ongeveer 160 eerstejaarsstudenten waren verantwoordelijk voor de eerste fenotypering van 320 roman transposon mutanten. Undergraduate onderzoek studenten aan drie instellingen deelgenomen aan de eerste fenotypering voor extra mutanten en de daaropvolgende karakterisering van veel van de stammen. De uitgebreide gegevens die zijn verkregen in een relatief korte periode van tijd, illustreren de waarde van de hier beschreven protocollen. Honderden extra mutanten zijn opgeslagen als glycerol mycelial voorraden voor toekomstige karakterisering.
Na de eerste experimenten hier beschreven, kan een verscheidenheid van methoden worden gebruikt om uit te breiden van de kwaliteit van de informatie met betrekking tot de stammen van belang. Als de mutatie niet bekend is, moet een genotypering-methode worden gebruikt om te bepalen het type en/of de locatie van de mutatie. Bijvoorbeeld, willekeurige transposon mutagenese van het wild-type chromosoom6,7,8,9,10,11,12,13 resulteert in kolonies die eerste fenotypische schermen zoals die beschreven hierboven moeten ondergaan. Vervolgens moet de locatie van het transposon worden vastgesteld met behulp van een techniek zoals inverse polymerase kettingreactie (iPCR)61. Bepaling van het genotype van de pas ontdekte mutanten is een belangrijke stap na eerste karakterisering.
Sommige veelgebruikte geavanceerde methoden voor de analyse van de latere fenotypering die kunnen worden vermeld in de klas of onderzocht door middel van verder onderzoek omvatten groen fluorescente proteïne (GFP) tagging om te bepalen van lokalisatie patronen voor de proteïne van belang, gen expressie analyses uitgevoerd, zoals real time kwantitatieve PCR (qPCR) en wereldwijde gen expressiepatronen van wild-type versus mutant via RNA Sequencing (RNA-seq). Fenotypering vaardigheden zijn eveneens vereist voor genetische complementatie analyse. In een experiment complementatie is de wild-type kopie van een gen in een gemuteerde stam om te bepalen of het toegevoegde allel van de verlies-van-functie van het gemuteerde allel compenseren kan binnengebracht. Het vergelijken van het fenotype van de aangevuld stam met die van de oorspronkelijke mutant zowel de ouderlijke, is wild-type stam vereist.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs wil erkennen Otterbein University voor Undergraduate Student onderzoeksbeurzen en Student Research Fund Awards GVK en SGK; de Otterbein Professor Gilbert E. Mills Memorial begiftigd Sabbatical programma Award en het departement biologie en aardwetenschappen faculteit Research and Scholarship Award naar JAB begiftigd. De Bert en Jane hoorn begiftigd Student Fonds voor onderzoek in de wetenschappen werd toegekend aan GVK en SGK. De auteurs wil ook graag mijn dankbaarheid uitspreken dat Duquesne University gefinancierd Undergraduate programma onderzoeksbeurzen voor GVK en SGK. Voormalige Juniata College undergraduate onderzoek studenten, Ryan Johnson en Lindsey Draper bijgedragen de microscopie beelden voor figuren 2 en 3, respectievelijk.
50% Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Immersion Oil (Type DF) | Cragille | 16482 | |
Lens Paper | Fisherbrand | 11-995 | |
Sterile Water | GeneMate | G-3250-1L | |
100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
Toothpicks (flat) | Target | 081-22-1957 | |
Pipette Tips (10 ml) | GeneMate | P-1240-10 | |
Pipette Tips (200 ml) | GeneMate | P-1240-200Y | |
Pipette Tips (1250 ml) | GeneMate | P-1240-1250 | |
Wooden Applicators 6'' | Solon Care | 070809 | |
Cotton Swabs | Fisherbrand | 23-400-124 | |
Soy Flour | Bob's Red Mill | 1516C164 | |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-1KG | |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
Glycerol 100% | VWR amresco life science | 0854-1L | |
0.8% NaCl (Saline) | Sigma-Aldrich | SLBB9000V | |
1.2 mL freezer tube | NEST | 606101 | |
Ultra low (-80°C) freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Cryo Safety Gloves | Bel-Art | H13201 | |
Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5856-500EA | |
Cover slips #1.5 | Thomas Scientific | 64-0721 | |
Slides | Carolina | 63-2010 | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540E | |
Phase-Contrast Microscope | Olympus | BX40 | |
Forceps | Carolina Biological | 624504 | |
Bunsen Burner | Carolina Biological | 706706 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
PBS (phosphate buffer saline) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
WGA-FITC | Biotium | 29022-1 | |
Clear nail polish | OPI | 22001009000 | |
Image J | NIH | Free Software | |
100 mL beaker | Pyrex USA | 1000-T | |
1 L beaker | Carolina Biological | 721253 | |
1 L flask | Fisherbrand | S63274 | |
250 mL flask | Pyrex USA | 4980 | |
100 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721788 | |
500 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721792 | |
Stir Bar | Fisher Scientific | 22-271825 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Camera for Microscope | Olympus | DP72 | |
Nitrile Examination Gloves (Med) | Bio Excell | 71011002 | |
Vortex Mixer | Carolina Biological | 701077 |