青緑色のメダカは、家し、標準ゼブラフィッシュ設備と同じインフラストラクチャを採用、一元的な水のろ過システムで個々 の魚の数千を効率的に上げるにスケール アップすることができますの研究室住宅。ここで我々 は効率的なメダカをメンテナンスできるように標準化されたプロシージャの一覧を詳しく説明します。
参照魚の確立からゼブラフィッシュとメダカなどのモデル システムの実験のために使用される非モデル実験室魚で飼育慣行の開発は大きく寄与しました。近年、増え続ける高齢化と生態の生物学の分野で研究グループによって新たな魚-ターコイズ メダカ (による furzeri) – を採用されています。4-8 ヶ月の拘束寿命、この種飼育で育った最も短命だった脊椎動物、高齢化率と平均余命の変化につながることができます – – 短期間でテスト実験的介入への科学界を可能です。胚の休眠によって特徴付けられる、この種のユニークな生物学を与えられた爆発性成熟マーク形態および行動の性の二形性 – と、比較的短い大人の寿命 –アドホック飼育の実践は、緊急需要。このプロトコルは、対策できる最適なターコイズ メダカ研究所ケア、強力な実験動物モデルとしてこの種を採用する科学的なコミュニティを有効にするキーのセットを報告します。
彼らの短い寿命のスパンと迅速なライフ サイクルを考えると、ターコイズ メダカが生物学1,2,3で有望な新しいモデル生物として急速に高まっています。この種は、硬骨魚類の胚の休眠、急速の性的成熟と生殖のロングライフ ステージ4,5で構成されるのユニークなライフ サイクルが特徴です。最近の作品は捕われの身と野生6、7の両方この種の生物学の解明に貢献しています。ターコイズ メダカが、ジンバブエやモザンビークにおいてアフリカのサバンナで梅雨の時期にそのフォームを季節の新鮮な水の体に住んでいます。乾燥する季節の間に胚は休眠と呼ばれるストレス耐性のライフ ステージのおかげで水のない状態で乾いた泥で生き残る。
この種の遺伝のマップは生成された8,9をされている、最近のゲノム シーケンスと組み立てられた10,11をされています。いくつかの近交系実験室魚株が開発され、遺伝子とゲノム CRISPR/Cas9 を介して編集が事実上競争力研究所脊椎動物のモデル生物として青緑色のメダカを推進、この種で利用可能になります。12,,1314。
この種の15のため、実験室のプロトコルは既に公開されているがこの議定書の高齢化と生存率の調査研究を具体的に目的とした実験ガイドラインの包括的なリストを開発します。この議定書によりなる青緑色のメダカ飼育でキー調整の最小数を採用することにより精通するゼブラフィッシュとメダカ飼育に既に精通している研究者です。同じ時に、このプロトコルは、盛んなターコイズ メダカ コロニーを高めるために不可欠なツールで魚飼育の経験のない研究者を提供します。
研究室は青緑色メダカ、採卵、孵化、成魚住宅などの養殖のためのプロトコルについて述べる、繁殖、供給します。我々 のプロトコル、特に老化と寿命に関する実験的研究、特に成魚に焦点を当てて研究を行う研究所をターゲットに。標準のゼブラフィッシュのファシリティで青緑色のメダカが発生します。ただし、メダカ飼育の重要な側面は、標準的なゼブラフィッシュ ケア16によって異なります。これらの調整には、胚培養、液体、乾燥インキュベーション ステージから成る特定の手順と同様に、タンパク質が豊富な血液ワームを添加した食事に塩水エビだけのダイエットから初期遷移があります。
プロトコルの中で重要なステップには 8-30 ° C の温度範囲内で送料の胚が含まれます。周波数と食品の品質を供給に依存して産卵、繁殖の場合したがって、我々 は胚収量 (セクション 5.6 を参照してください。) を高めるためにタンクを繁殖につき一日に少なくとも 2 つの授乳をお勧めします。胚は漂白、中に漂白液で胚培養を拡張しません。卵の絨毛膜と増加胚死亡率を傷つけるをおそれがあります。メチレン ブルーを持つ胚を培養するときは 2 週間以上の生存率は劇的に減ると準備ができて-ハッチング胚の孵化を長引かせるありません。青緑色のメダカを孵化、フミン酸溶液の低温孵化が向上、ソリューションの胚の完全な浸漬により、同期の孵化。十分な通気ガス膀胱を埋めることができないフライの高レートの培養結果中 (「腹スライダー」表現型、セクション 5.1 でメモを参照してください)。
繁殖のプロトコルの制限には、どのポーズ課題集中ろ過システム、将来的に別の方法で置き換える必要があります砂の基板の使用が含まれています。可能な選択肢は、ゼブラフィッシュ飼育タンクの使用可能性があります。胚の漂白で変更された絨毛膜の生理学および成功を孵化卵の絨毛膜の主要な物理化学的変化の原因。メチレン ブルーに胚の一定の暴露が成魚の生理学の長期的変化を誘発します。魚類の行動と健康に生存コホート研究のため個々 のタンクの成魚を上げるかもしれない悪影響します。しかし、生存コホート研究グループ ・ ハウジングは、厳格な社会階層につながる社会的順位と男性の領土の確立による交絡因子を追加します。したがって、生存研究オスの魚の隔離が合理的な妥協であることを判断します。非制御震源から生きた餌給餌研究所メダカ コロニーは、寄生虫や病原微生物から外部汚染のリスクを追加します。将来は、アドホック滅菌飼料を開発する必要があります。
このプロトコルの将来の改善はまだ 3-4 週間以内に性的成熟を完了する導く制御、非ライブ ダイエットに焦点を当てます。要約すると、我々 のプロトコルは、広い科学界に青緑色のメダカ研究所培養へのアクセスを提供しています。
The authors have nothing to disclose.
ありがとうアレッサンドロ ・ Cellerino、ロン Genade、アン黒髪、サブリナ シャープ、ミッキー ・ パウエル、シモーネ Keil、ゆみキム、パトリック ・ スミス、改オーナーマ タール、Valenzano 研究室のすべてのメンバー、マックス ・ プランク研究所で老化の生物学のさまざまな側面に貢献すること長年にわたり現在のメダカ飼育プロトコル。
Probe calibration buffer solution pH=7.0 | Roth | A518.1 | 1L buffer solution pH=7.0 to calibrate water system pH-electrode |
Probe calibration buffer solution pH=4.0 | Roth | P712.1 | 1L buffer solution pH=4.0 to calibrate water system pH-electrode |
Conductivity standard | VWR | 83607.260 | 500 mL Conductivity standard 1,413 uS/cm to calibrate water system conductivity-electrode |
Easy Strips Test 6in1 | JBL | 2533900 | Test strips for determination chlorine values of system water |
Ammonia Test | JBL | 2536500 | Test to determine ammonia content of system water |
Red Sea Salt | Red Sea | 22 kg bucket | |
Sodium hydrogen carbonate | VWR | 27780.360 | |
Humic acid | Sigma- Aldrich | 53680-50G | |
New HUFA Artemia enrichment | ZM Systems UK | 75g bottle | |
Methylene blue | Roth | AE64.1 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma- Aldrich | 31642-1L | 30% (w/w) |
Cononut fiber | Dragon | ZCS010 | |
Whatman paper | GE healthcare | 3030-690 | |
Ethanol pure | VWR | 20821.467 | 100% |
Silica sand | local pet shop | ||
Artemia Eggs Premium Grade | Sanders | ||
Bloodworm | local distributor | Poseidon Aquakultur Germany | |
dNTPs solution mix | Biolabs | N04472 | 10mM |
Taq DNA polymerase | Invitrogen | 18038-042 | 5U/uL |
PCR 10x Buffer | Invitrogen | 18038-042 | |
MgCl2 | Invitrogen | 18038-042 | 50mM |
NaOH | Sigma- Aldrich | S8045-500g | 50mM |
Tris-HCl, pH=8.0 solution | Sigma- Aldrich | T2694-1L | 1M |
HCl 37% | Sigma- Aldrich | H1758-500mL | |
Aquatic housing system | Aquaneering | Central filtration equipped aquatic system | |
Fish tanks | Aquaneering | volume: 0.8L, 2.8L, 9.5L; equipped with baffles, fry mesh and lids | |
Orbital shaker | VWR | 89032-100 | model 5000 |
Microbiological incubator | Thermo Scientific, Heratherm | 50125882 | model IMC18; for storage embryos in the liquid phase, set to t=27-28°C |
Cooling Incubator | Binder | 9020-0209 | model KT115; for storage embryos in the solid phase, set to t=27-28°C |
Hatching incubator | Thermo Scientific, Heratherm | 51028114 | model OGS180; for embryos hatching, set to t=27-28°C |
Stereomicroscope | Leica | model M80 | |
Breeding sand/hatching boxes | Roth | 1598.1 | 1000mL |
Petri dish | Sarstedt | 82.1473 | 92x16mm |
50mL Conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
15mL Conical tube | Sarstedt | 62.554.002 | |
Disposable Plastic Pasteur pipette | Roth | EA71.1 | 2mL; For fish feeding with bloodworms, or embryos selection cut off the tip to open 3-4mm diameter |
Serological pipette | Sarstedt | 86.1689.001 | 50mL |
Syringe | Henke Sass Wolf | 4100-000V0 | 10mL |
Metal strainer | fineness <1mm; for embryos collection | ||
Tweezers | Dumont | 0508-5/45-PO | type5/45; for embryos transfer |
25L Brine shrimps hatcher | Aquaneering | ZHBS25 | main hatcher |
500mL Brine shrimps hatcher | JBL | 6106100 | model Artemio 1; backuo hatcher |
Narrow-mesh fish nets | JBL | ||
Sand beaker | VWR | BURK7102-5000 | 5000mL |
Brine shrimps separation beaker | VWR | BURK7102-2000 | 2000mL |
Plastic zipper bag | Roth | P279.2 | for dead fish storage |
Pipetboy | Integra | 155000 | model Pipetboy acu2 |
Parafilm | P-Lab | P701605 | |
Air tubing | www.zajac.de | AQ380 | 4-6 mm diameter |
1L Glass bottle | VWR | 215-1595 | |
2L Glass bottle | VWR | 215-1596 | |
500mL Squeeze bottle | Roth | K665.1 | for fish feeding with brine shrimps |
120 micron brine shrimps strainer | Florida Aqua Farms | BB-PC2 | for brine shrimps/bloodworm collection |
Finish filter socks | Aquaneering | MFVB025C | 25 micron |
Central filtration fish housing system | Aquaneering, Techniplast, Aquatic Habitats, Aqua Schwarz |