مختبر الإسكان تركواز killifish يمكن زيادتها إلى البيت ورفع كفاءة آلاف أسماك الفردية في نظام تنقية مياه مركزية، تستخدم نفس البنية الأساسية المستخدمة لمرافق الزرد القياسية. هنا نحن بالتفصيل قائمة بإجراءات موحدة تسمح killifish كفاءة الصيانة.
تطوير ممارسات تربية الأسماك المختبر غير النموذجية المستخدمة لأغراض تجريبية قد استفاد كثيرا من إنشاء مرجع الأسماك نظم نموذجية، مثل الزرد والميداكا. في السنوات الأخيرة، اعتمد أسماك ناشئة – killifish الفيروز (فورزيري نوثوبرانتشيوس) – بعدد متزايد من المجموعات البحثية في المجالات البيولوجيا الشيخوخة والإيكولوجيا. مع فترة حياة الأسير من 4-8 شهور، هذه الأنواع هي فقاريات شورتيستليفيد التي أثيرت في الأسر ويسمح المجتمع العلمي للاختبار – في وقت قصير – التدخلات التجريبية التي يمكن أن تؤدي إلى تغييرات معدل الشيخوخة ومتوسط العمر المتوقع. نظراً لبيولوجيا فريدة من نوعها لهذه الأنواع، وتميزت ديبوس الجنينية، النضج الجنسي المتفجرة، تميز مظهري الجنسي المورفولوجية والسلوكية-وفترة حياتها قصيرة نسبيا الكبار-تربية المخصصة الممارسات في العاجلة الطلب. ويفيد هذا البروتوكول مجموعة من التدابير الرئيسية تربية تسمح killifish الفيروز الأمثل مختبر الرعاية، وتمكين المجتمع العلمي على اعتماد هذه الأنواع كنموذج حيوانات مختبرية قوية.
نظراً لفترة قصيرة في الحياة ودورة الحياة السريع، تتزايد killifish الفيروز سريعاً ككائن نموذج جديد يبشر بالخير في البيولوجيا1،،من23. وتتميز هذه الأنواع بدوره الحياة فريدة من نوعها تيليوست، تتألف من ديبوس الجنينية، السريع النضج الجنسي، وحياة الأنثوية تمديد مرحلة4،5. العمل الأخيرة قد ساهم في توضيح البيولوجيا من هذا النوع في الأسر وفي البرية6،7. ويعيش killifish الفيروز في مسطحات المياه العذبة الموسمية هذا النموذج أثناء موسم الأمطار في السافانا الأفريقية في زيمبابوي وموزمبيق. خلال موسم الجفاف، الأجنة البقاء على قيد الحياة في الطين الجاف وفي غياب المياه بحكم مرحلة حياة مقاوم لإجهاد تسمى ديبوس.
الخرائط الوراثية لهذه الأنواع قد ولدت8،9، وعلى الجينوم في الآونة الأخيرة المتتابعة وتجميعها10،11. ووضعت العديد من السلالات السمكية مختبر الفطرية، وأصبحت متاحة في هذه الأنواع، الواقع تعزيز killifish الفيروز ككائن نموذج فقاريات مختبر تنافسية ترانسجينيسيس والجينوم التحرير عن طريق كريسبر/Cas9 1213،،14.
على الرغم من أن بروتوكول مختبر تم نشرة بالفعل لهذه الأنواع15، في هذا البروتوكول أننا وضع قائمة شاملة من المبادئ التوجيهية المختبرية التجريبية التي تستهدف على وجه التحديد الدراسات التحقيق في الشيخوخة والبقاء على قيد الحياة. ويتيح هذا البروتوكول الباحثين دراية الزرد والميداكا تربية تصبح على دراية بتربية killifish الفيروز باعتماد عدد أدنى من التعديلات الرئيسية. في الوقت نفسه، يوفر هذا البروتوكول الباحثين دون خبرة سابقة في مجال تربية الأسماك مع الأدوات الأساسية لرفع مستعمرة killifish الفيروز مزدهرة.
يمكننا وصف بروتوكول لاستزراع المختبر من killifish الفيروز، بما في ذلك جمع الجنين، والحضانة، فضلا عن السكن الأسماك الكبار، والتربية، والتغذية. لدينا بروتوكول يستهدف على وجه التحديد إلى مختبرات أبحاث تركز على الأسماك الكبار، وبخاصة للدراسات التجريبية المتعلقة بالشيخوخة ومدى الحياة. ويمكن رفع killifish الفيروز على مرفق الزرد قياسية؛ ومع ذلك، تختلف جوانب هامة لتربية killifish الزرد معيار الرعاية16. وتشمل هذه التعديلات الانتقال المبكر من اتباع نظام غذائي فقط الماء المالح الروبيان بحمية تستكمل مع دودة الدم الغني بالبروتين، فضلا عن اتخاذ خطوات محددة في حضانة الجنين، تتكون من مرحلة الحضانة السائلة والجافة.
وتشمل الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول الأجنة الشحن داخل نطاق درجة الحرارة 8-30 درجة مئوية. في حالة تربية، الخصوبة يعتمد على التغذية وتواتر ونوعية الأغذية؛ ولذلك، نوصي اﻹطعام اثنين على الأقل يوميا لتربية الدبابات لرفع الغلة الأجنة (انظر الفرع 5.6.). أثناء تبيض الجنين، لا تمتد حضانة الجنين في الحل تبيض. وهذا قد يسبب الضرر للمشيمة بيضة ووفيات الأجنة زيادة. عند حضانة الأجنة مع أزرق الميثيلين، لا نطيل حضانة الأجنة جاهزة لفتحه لفترة أطول من أسبوعين كما سيتم خفض قابليتها جذريا. الفقس killifish الفيروز، يحسن درجة الحرارة منخفضة لحل الأحماض الدبالية الفقس والغمر الكامل للأجنة في الحل يسمح الفقس متزامنة. تهوية غير كافية خلال نتائج حضانة في المعدلات العالية لجمهورية يوغوسﻻفيا الاتحادية غير قادرة على ملء المثانة الغاز (النمط الظاهري “بطن-المنزلق”، انظر الملاحظات في المقطع 5.1).
يتضمن القيد للبروتوكول من أجل تربية استخدام الركيزة الرملية التي تطرح تحديات على مركزية نظم الترشيح وينبغي الاستعاضة عن الأساليب البديلة في المستقبل. يمكن أن تكون البدائل الممكنة استخدام الزرد تربية الدبابات. تبيض الجنين يمكن أن تسبب التغيرات الفيزيائية-الكيميائية الرئيسية في المشيمة البيض الذي يمكن أن يسفر عن المشيمة غيرت علم وظائف الأعضاء والفقس النجاح. التعرض المستمر للأجنة إلى أزرق الميثيلين قد تؤدي التغيرات الطويلة الأجل في فسيولوجيا الأسماك الكبار. تربية الأسماك الكبار في صهاريج الفردية للدراسات الفوجية البقاء على قيد الحياة قد تؤثر سلبا على سلوك الأسماك والصحة. مع ذلك، يضيف مجموعة مساكن للدراسات الفوجية بقاء عوامل التباس بسبب إنشاء الهيمنة الاجتماعية والأقاليم الذكور، مما يؤدي إلى الهرمية الاجتماعية الصارمة. ولذلك نحكم أن عزل الأسماك الذكور للدراسات البقاء على قيد الحياة حل وسط معقول. إضافة تغذية المستعمرات killifish المختبر مع الغذاء الحي من المصادر التي تسيطر عليها الأمم المتحدة خطر للتلوث الخارجي من الطفيليات والمجتمعات الميكروبية المسببة للأمراض المحتملة. في المستقبل، وينبغي تطوير أعلاف معقمة مخصصة.
إدخال تحسينات في المستقبل على هذا البروتوكول سيركز على نظام غذائي الخاضعة للمراقبة، وغير مباشر، الأمر الذي لا يزال يؤدي إلى استكمال النضج الجنسي في 3-4 أسابيع. وباختصار، يقدم لدينا بروتوكول الوصول إلى killifish الفيروز استزراع مختبر لمجتمع علمي على نطاق واسع.
The authors have nothing to disclose.
نشكر سيليرينو أليساندرو، تايرون جندي، برونيه أن، شارب سابرينا، ميكي بأول، Keil سيمون، كيم Yumi، باتريك سميث، مطهر كاي وجميع الأعضاء في مختبر فالينزانو في معهد ماكس بلانك “علم الأحياء للشيخوخة” للإسهام في جوانب مختلفة بروتوكول تربية killifish الحالية على مر السنين.
Probe calibration buffer solution pH=7.0 | Roth | A518.1 | 1L buffer solution pH=7.0 to calibrate water system pH-electrode |
Probe calibration buffer solution pH=4.0 | Roth | P712.1 | 1L buffer solution pH=4.0 to calibrate water system pH-electrode |
Conductivity standard | VWR | 83607.260 | 500 mL Conductivity standard 1,413 uS/cm to calibrate water system conductivity-electrode |
Easy Strips Test 6in1 | JBL | 2533900 | Test strips for determination chlorine values of system water |
Ammonia Test | JBL | 2536500 | Test to determine ammonia content of system water |
Red Sea Salt | Red Sea | 22 kg bucket | |
Sodium hydrogen carbonate | VWR | 27780.360 | |
Humic acid | Sigma- Aldrich | 53680-50G | |
New HUFA Artemia enrichment | ZM Systems UK | 75g bottle | |
Methylene blue | Roth | AE64.1 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma- Aldrich | 31642-1L | 30% (w/w) |
Cononut fiber | Dragon | ZCS010 | |
Whatman paper | GE healthcare | 3030-690 | |
Ethanol pure | VWR | 20821.467 | 100% |
Silica sand | local pet shop | ||
Artemia Eggs Premium Grade | Sanders | ||
Bloodworm | local distributor | Poseidon Aquakultur Germany | |
dNTPs solution mix | Biolabs | N04472 | 10mM |
Taq DNA polymerase | Invitrogen | 18038-042 | 5U/uL |
PCR 10x Buffer | Invitrogen | 18038-042 | |
MgCl2 | Invitrogen | 18038-042 | 50mM |
NaOH | Sigma- Aldrich | S8045-500g | 50mM |
Tris-HCl, pH=8.0 solution | Sigma- Aldrich | T2694-1L | 1M |
HCl 37% | Sigma- Aldrich | H1758-500mL | |
Aquatic housing system | Aquaneering | Central filtration equipped aquatic system | |
Fish tanks | Aquaneering | volume: 0.8L, 2.8L, 9.5L; equipped with baffles, fry mesh and lids | |
Orbital shaker | VWR | 89032-100 | model 5000 |
Microbiological incubator | Thermo Scientific, Heratherm | 50125882 | model IMC18; for storage embryos in the liquid phase, set to t=27-28°C |
Cooling Incubator | Binder | 9020-0209 | model KT115; for storage embryos in the solid phase, set to t=27-28°C |
Hatching incubator | Thermo Scientific, Heratherm | 51028114 | model OGS180; for embryos hatching, set to t=27-28°C |
Stereomicroscope | Leica | model M80 | |
Breeding sand/hatching boxes | Roth | 1598.1 | 1000mL |
Petri dish | Sarstedt | 82.1473 | 92x16mm |
50mL Conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
15mL Conical tube | Sarstedt | 62.554.002 | |
Disposable Plastic Pasteur pipette | Roth | EA71.1 | 2mL; For fish feeding with bloodworms, or embryos selection cut off the tip to open 3-4mm diameter |
Serological pipette | Sarstedt | 86.1689.001 | 50mL |
Syringe | Henke Sass Wolf | 4100-000V0 | 10mL |
Metal strainer | fineness <1mm; for embryos collection | ||
Tweezers | Dumont | 0508-5/45-PO | type5/45; for embryos transfer |
25L Brine shrimps hatcher | Aquaneering | ZHBS25 | main hatcher |
500mL Brine shrimps hatcher | JBL | 6106100 | model Artemio 1; backuo hatcher |
Narrow-mesh fish nets | JBL | ||
Sand beaker | VWR | BURK7102-5000 | 5000mL |
Brine shrimps separation beaker | VWR | BURK7102-2000 | 2000mL |
Plastic zipper bag | Roth | P279.2 | for dead fish storage |
Pipetboy | Integra | 155000 | model Pipetboy acu2 |
Parafilm | P-Lab | P701605 | |
Air tubing | www.zajac.de | AQ380 | 4-6 mm diameter |
1L Glass bottle | VWR | 215-1595 | |
2L Glass bottle | VWR | 215-1596 | |
500mL Squeeze bottle | Roth | K665.1 | for fish feeding with brine shrimps |
120 micron brine shrimps strainer | Florida Aqua Farms | BB-PC2 | for brine shrimps/bloodworm collection |
Finish filter socks | Aquaneering | MFVB025C | 25 micron |
Central filtration fish housing system | Aquaneering, Techniplast, Aquatic Habitats, Aqua Schwarz |