Özet

정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드

Published: December 28, 2017
doi:

Özet

제시 여기 경작 하는 수정 된 롤러 튜브 방법 이며 photoetched coverslips에 정확한 위치와 많은 주 동안 설치류 두뇌의 간헐적인 고해상도 이미징 조각. 신경 생존 및 슬라이스 형태로 잘 유지 됩니다. 셀 형 특정 식에 대 한 바이러스를 사용 하 여이 완전히 동봉 된 시스템의 응용 프로그램에 제공 됩니다.

Abstract

교양된 설치류 두뇌 분할은 신경 및 그들의 정상적인 vivo에서 상호 작용의 대부분을 유지 하는 환경에서 명과의 세포질이 고 분자 행동을 공부 하 고 유용 합니다. 다양 한 유전자 변형 마우스 라인 또는 붙일 태그가 단백질 또는 야생 타입 두뇌 조각에서 기자 들의 표현에 대 한 바이러스 성 벡터의 사용에서 얻은 조각 고해상도 이미징 형광 현미경 검사 법에 의해 허용. 비록 뇌 조각, 조각 문화를 결합 하 여 수행 하는 기능을 영상에 대 한 여러 가지 방법을 개발 되었습니다 오래 기간 동안 라이브 분할 영역에 특정 셀의 반복적인 고해상도 이미징 문제 행 세 하고있다. 이것은 최고의 사용자를 보호 하 고 교차 오염을 방지 하는 닫힌된 시스템에서 수행 하는 이후 외 인 단백질의 표현에 대 한 바이러스 성 벡터 사용 하는 경우 이것은 특히 사실. 간단한 수정 롤러 튜브 뇌 조각 문화 방법에 많은 주 동안 조각의 반복 고해상도 이미징 동봉된 시스템에서 허용 하는 보고 됩니다. 경작 photoetched coverslips에서 조각 신속 하 고 정확 하 게 다른 치료 전후 시간이 지남에 동일한 필드를 이미지를 무대 위치를 표준 마크의 사용을 허용 합니다. 예 특정 신경 얼룩 및 hippocampal 조각 건축에서 변화를 관찰 하는 식, 형광 단백질의 바이러스 중재 신경 식 및 cofilin 병리학의 개발이이 방법의 사용에 대 한 표시 됩니다. 이전 아 밀 로이드 β (Aβ) 펩 티 드의 올리고 슬라이스 치료 응답에 Alzheimer의 질병 (광고)의 해 마에서 관찰 되었다.

Introduction

해리 신경 설치류 두뇌의 지역에서의 기본 문화 연구자에 의해 병 적 응답을 관찰 하는 데 사용 하는 중요 한 도구 연루 자극 이다. 그러나, 이러한 연구 결과 뉴런만 2d에서 고 glial 지원 시스템 없이 보는 단점이 있다. 또한, 그것에 매우 높은 밀도 (640 뉴런/m m2 또는 표면적의 약 16%)의 조건 하에서 성장 하지 않는 한 불가능 하다 hippocampal 세포 몸, 짧은 거리 보다 더 모 수석 또는 축 삭의 무작위 결과 따라 신경 생존 4 주 이상1을 제한 연령 관련 pathologies의 확장된 연구에 대 한 천연된 문화를 사용 하 여 크게 떨어진다. 쥐 두뇌에서 준비 하는 조각의 경작 주 또는 몇 개월에 대 한 조직된 세포 건축과 생존 능력을 유지 하 여 이러한 한계를 극복 하는 매력적인 옵션 이다. 조각 문화에 설치류 두뇌의 많은 다른 영역을 유지 하기 위한 조건 설명된2되었습니다.

두 가지 주요 방법을 뇌 조각의 장기적인 문화 위해 널리 이용 된다: 공기-액체 인터페이스3 막에 경작 또는 밀봉 된 튜브에 coverslips에 경작 폭4를 제공 하는 롤러 인큐베이터에서 회전 수. 세포 막에 경작 하는 조각 직 립 현미경과 물 집중 목표5를 사용 하 여 고해상도 형광 현미경으로 직접 몇 군데 될 수 있습니다. 또는, 조각 세포 막에 교양 있다 유리 하단 요리는 거꾸로 한 현미경6을 사용 하 여 모 수석 등뼈의 좋은 해상도 달성 하기 위해 양도 되었습니다. 그러나, 두 방법 모두 세포 막에 성장 조각 이미징의 중간 변화를 필요로 하 고 자주를 방지 하거나 줄이기 위해 오염5,6antifungal 항생제 사용할 오픈 시스템 있습니다. 공기-매체 인터페이스에서 막에 조각 우수한 형태 및 생존, 유지 하지만 실험만 작은 셀 그룹에 다음과 같은 하지 않으면 높은 확대에 반복적인 이미징 동안 정확한 위치에 반환 하는 것은 매우 어려운 형광 성 감 적 표현. 세포 막에 성장 조각 transgenes5,6의 바이러스 중재 식이 사용 되었습니다, 비록 biosafety 프로토콜 동봉된 문화 시스템에 사용 되는 특정 바이러스 성 벡터에 대 한 고용 수 필요할 수 있습니다. 단백질 및 세포 생리학의 기자 태그 붙일 표현. 또한, 침수 목표 문화5에 따라 샘플 사이 오염 제거를 해야 합니다. 막 인터페이스 문화의 주요 응용 프로그램 시간 포인트7에서 생리학과 고해상도 이미징을 결합 이다.

플라스틱 튜브 안에 coverslips와 롤러 튜브 메서드는 coverslip 제거 하지 않고 어떤 전기 생리학 또는 고해상도 이미징 허용 하지 않습니다. 따라서,이 메서드는 장기 연구는 후 고정 관찰 한8에 가장 자주 적용 되었다. 여기에 설명 된 롤러 튜브 문화 기술을 활용 하지만 만큼 문화에 대 한 반복적으로 몇 군데 수 coverslips에 조각으로 교 련된 아웃 튜브에 유지 되는 방법이입니다. 동봉 된 시스템 이미징에 대 한 중간 변화를 요구 하 고 높은 확대, 일 또는 주 후에 정확한 필드 이전 몇 군데 이미징 수 있도록 하는 표준 마크를 제공 하는 photoetched coverslips를 활용 하 여.

우리 쥐 해 마 메모리 및 학습에 관련 된 주요 뇌 영역에에서 변화를 검사 하려면이 메서드를 적용 합니다. 쥐 해 마 종종 병 적인 또는 연령과 관련 된 변화 인지 장애9, 광고에서 발생 하는 개발 하는 동안 관찰 모델으로 공부 된다. 우리의 방법은 AD8의 특징은 Aβ 펩 티 드, 증가 등 환경 변화에 대 한 응답에서 시간이 지남에 단일 슬라이스 내에서 개발 하는 병리학 변화를 공부 하는 특히 적합 합니다. 한 병리학 인간과 설치류 광고 뇌와 관련 된 cofilin 걸의 존재 이며 봉, 필 라 멘 트 cofilin와 말라의 후자 포함 번들은 1:1 어 금 니 비율10,11, 12. 봉 고정 조각 cofilin GFP hypoxia8, 대상이 표현 라이브 설치류 뇌 조각 내에서 뿐만 아니라 쥐 해 마 Aβ 치료 따르는의 관찰 되었습니다 그리고 그들은 광고에서 본 시 냅 스 기능 장애에 기여할 수 그리고 선입니다. 여기 우리는 시간 코스와 다른 바이러스에 의해 도입 된 표현된 exogenous 공상 형광 단백질의 조각 내에서 분산을 관찰 하는 것이 새로운 자란 메서드를 사용 합니다. 우리는 다음 cofilin 막대 및 수용 성 Aβ 올리고 (Aβo)와 치료에 대 한 응답에서 hippocampal 조각에 집계 병리학의 발전에 따라 cofilin 기자 구문의 신경 특정 식을 이용 한다.

Protocol

동물 사용 동물 관리 및 사용 지침의 콜로라도 주립 대학에 승인 된 사육 및 동물 사용 프로토콜 준수는 다음과 같습니다. 참고: 프로토콜 아래 장기 인큐베이션 및 hippocampal 조각의 간헐적인 이미징에 대 한 준비 및 문화 메서드를 설명합니다. 단일 hippocampal 슬라이스 플라즈마 응고를 사용 하 여 특별히 준비 photoetched coverslip에 연결 하 고 롤러 인큐베이터에서 유지 됩니다 교 …

Representative Results

얼마나 정확 하 게 확인 하려면 표준 마크를 활용할 수 있는 시간이 지남에 같은 필드 내에서 동일한 셀을 이미지 복원, 하 우리 검사 photoetched coverslips (그림 6A)에 성장 하는 조각. 뉴런은 중요 한 염료와 염색 법에 의해 시각 (100 nM 2 h;에 대 한 비 신경 세포를 얼룩이 되지 않습니다)는 셀25를 해치지 않고 시간이 지남에 ?…

Discussion

여기에 설명 된 롤러 튜브 메서드 장기 배양 및 슬라이스 뇌 조직의 고해상도 라이브 이미징에 대 한 수 있습니다. 장착 및 유지 보수의 조각에 슬라이스 기법으로 여기 적용 한 주요 문제가입니다. Coverslip 코팅 슬라이스 접착을 지 원하는 홍보 조각 조각;에서 셀의 마이그레이션 및 neurites의 파생물을 강화 하 여 숱이 따라서, 우리는이 기판의 사용을 피 했다. 3-aminopropyltriethoxysilane와 함께 처리 하 …

Materials

Bottoms from 15 cm culture dishes VWR Scientific 25384-326
Phillips Head Machine Screws (#10-32) Ace Hardware 2.5" long and 3/16" in diameter
Flat Washers #10 ACE Hardware
Machine Screw Nuts (#10-32) ACE Hardware
Rubber Grommets  ACE Hardware 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD
Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) ACE Hardware Cut to 1.8" length
Lock Washer #10 ACE Hardware
Drill Press, 5 speed  Ace Hardware ProTech Model 1201
Nunclon Delta Flat-Sided Tubes VWR 62407-076
Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm  Ace Hardware Diablo freud brand Drill bits for cutting plastic.
Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm Ace Hardware
Wood file, 1/4" round Ace Harware
Spring clips, 16 mm snap holder Ace Hardware
Swivel Head Deburring Tool, 5" Ace Hardware 26307
Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) Grace Bio-Labs 666581 0.5 mm Thickness
6 mm hole punch Office Max
12 mm hole punch thepunchbunch.com
70% Ethanol
Phototeched Coverslips, 12 mm diameter Bellco Glass, Inc. 1916-91012
Bunsen Burner
Absolute Ethanol
Nanopure Water
3-aminopropyltriethoxylane Sigma-Aldrich A3648
Acetone Sigma-Aldrich 179124
#5 Dumont Forceps Fine Science Tools 11251-30
McIlwain Tissue Chopper Ted Pella, Inc. 10180
Double Edge Razor Blades Ted Pella, Inc. 121-6
Whatman Filter Paper VWR 28450-182 Cut into 5.8 cm diameter circles
Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) Ted Pella, Inc. 10501-10 Cut into 5.8 cm diameter circles
#21 Surgical Blade VWR Scientific 25860-144
#5 Dumont Forceps Fine Science Tools 11251-30
Spatula, stainless with tapered end VWR 82027-518
Gey's Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich G9779 
 Glucose ThermoFisher Scientific 15023-021 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized
Chicken Plasma Cocalico Biologicals 30-0300-5L Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at  -80 °C.
Thrombin, Bovine Fisher 60-516-01KU 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C.
Cell Roller System Bellco Biotech SciERA
Roller Incubator Forma Model 3956
N21-MAX ThermoFisher Scientific AR008
Pen/Strep (100X) ThermoFisher Scientific 15140122
200 mM Glutamine ThermoFisher Scientific 25030081
Glucose ThermoFisher Scientific 15023-021 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized
Neurobasal A ThermoFisher Scientific 10888-022  Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep.
Third generation lentivirus packaging Life Technologies K4975-00
159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) EMD Millipore
Lentiviral cloning system (InFusion) Clonetech
Plasmids 30323, 50856, 51279 Addgene
Neuronal cell viability dye (NeuO) Stemcell technologies 1801 Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C
Inverted microscope Olympus IX83
Microscope objectives Olympus air: 4X, 20; oil: 40X, 60X,
Spinning disc confocal system Yokagawa CSU22
Microscope EMCCD camera Photometrics Cascade II
Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage ASI
Microscope lasers and integration Intelligent Imaging Innovations
HEK293T cells American Type Culture Collection CRL-3216
Human Plasmin Sigma Aldrich P1867 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C.

Referanslar

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