רולר ששונתה שיטת צינור לדימות לסירוגין במדויק לשפות אחרות וחוזר על עצמו במהלך תרבות לטווח ארוך של פרוסות המוח בכל מערכת סגורה

התרבות העיקרי של נוירונים הפומבית מאזורים במוח מכרסמים היא כלי חשוב משמשים חוקרים לבחון את התגובות באופן פתולוגי בהפרות גירויים. אולם, מחקרים כאלה יש החיסרון להסתכל על נוירונים בדו מימד בלבד וללא מערכת תמיכה גליה שלהם. יתר על כן, אלא אם כן גדל בתנאים של צפיפות גבוהה מאוד (640 מ”מ/נוירונים² או כ- 16% של שטח פנים) אותה הופכת בלתי אפשרי לעקוב את תוצר אקראי של דנדריט או האקסון יותר במרחק קצר מן הגוף תא, בהיפוקמפוס הכדאיות עצביים מעל 4 שבועות מסרב באופן משמעותי¹, הגבלת השימוש של תרבויות הפומבית ללימודים מורחבים של פתולוגיות הקשורות לגיל. Culturing הפרוסות מקריסטלים של המוח מכרסמים הוא אופציה אטרקטיבית מתגבר על מגבלות אלה על-ידי שמירה של ארכיטקטורה התא מאורגן ואת הכדאיות במשך שבועות או חודשים. תנאים לשמירה על אזורים שונים רבים של המוח מכרסמים בתרבות פרוסה כבר מתואר².

שתי שיטות העיקריים נמצאים בשימוש נרחב עבור תרבות לטווח ארוך של פרוסות המוח: culturing על ממברנות אוויר נוזלי ממשק³ או culturing על coverslips צינורות אטום הרשאה עושה סיבוב חממה רולר לספק אוורור⁴. פרוסות תרבותי על ממברנות יכול לדימות ישירות עם מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה פלורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ זקופה של מים טבילה מטרות⁵. לחלופין, פרוסות תרבותי על ממברנות הועבר לטיפולו כלי הזכוכית התחתונה כדי להשיג ברזולוציה טובה של הדנדריטים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה של⁶. עם זאת, שתי שיטות הדמיה פרוסות גדל על ממברנות הן מערכות פתוחות דורשים שינויים בינוני, לעתים קרובות להשתמש פטריות ו/או אנטיביוטיקה כדי למנוע או להפחית זיהום^5,6. פרוסות על קרום-הממשק אוויר-בינוני לשמור על הישרדות ומורפולוגיה מעולה, אך חוזרים שוב ושוב אל מיקומים מדויקים במהלך דימות חוזרות בהגדלה גדולה היא משימה קשה ביותר, אלא אם הניסוי הוא בעקבות קבוצות קטנות בלבד של תאים הבעת סמן פלורסנט. למרות פרוסות גדל על ממברנות השתמשו בביטוי ויראלי בתיווך של^5,transgenes⁶, פרוטוקולי אבטחה עשויה לדרוש מערכת תרבות סגורה להיות מועסק מסוימים וקטורים ויראלי המשמשים עבור ביטוי fluorescently מתויגות חלבונים ו כתבים של פיזיולוגיה של התא. יתר על כן, מטרות טבילה דורשים טיהור בין הדגימות שהופיעו לאחר מכן תרבות⁵. יישום מרכזי אחד של תרבויות ממשק ממברנה היא שילוב הדמיה ברזולוציה גבוהה עם אלקטרופיזיולוגיה-פעם נקודות⁷.

שיטת צינור רולר עם coverslips בתוך צינור פלסטיק אינו מתיר כל אלקטרופיזיולוגיה או הדמיה ברזולוציה גבוהה מבלי להסיר את coverslip. לכן, בשיטה זו הוחלה לרוב על מחקרים ארוכי טווח שבו קיבוע שאחרי תצפיות שנעשו⁸. המתוארים כאן היא שיטה מנצל את הטכניקה תרבות של שפופרת רולר, אך על צינורות קדח-אאוט עם פרוסות על coverslips זה יכול לדימות שוב ושוב ככל התרבויות נשמרים. מערכת סגורה דורש שינוי בינונית עבור הדמיה, מנצל photoetched coverslips לספק סימני fiducial לאפשר הדמיה בהגדלה גדולה, לאחר ימים או שבועות, השדות מדויק בעבר עם תמונה.

אנו מיישמים שיטה זו לבחון שינויים בהיפוקמפוס מכרסמים, אזור מרכזי המוח המעורבים זיכרון ולמידה. מכרסמים ההיפוקמפוס הוא למד לעיתים קרובות כמודל עבור שינויים פתולוגיים או הקשורות לגיל נצפתה במהלך הפיתוח של פגיעה קוגניטיבית⁹, כגון אלה המתרחשות לספירה. השיטה שלנו מתאימה במיוחד ללמוד שינויים פתולוגיים להתפתח בתוך פרוסה אחת לאורך זמן בתגובה לשינויים סביבתיים, כגון העלאות Aβ פפטידים, אשר מאפיינת של המודעה⁸. פתולוגיה אחד המשויך מכרסמים ואנושי המוח לספירה היא הנוכחות של cofilin-אקטין אגרגטים והם מוטות, חבילות המכילות האחרון של חוטים cofilin, אקטין 1:1 יחס טוחנת^{10,11, 12}. נצפו מוטות פרוסות קבוע של ההיפוקמפוס עכברוש לאחר הטיפול Aβ, כמו גם בתוך פרוסה המוח מכרסם חי לבטא cofilin-GFP נתון היפוקסיה⁸, הם עשויים לתרום תפקוד סינפטית ראיתי במודעה וקו. כאן אנו משתמשים culturing שיטה חדשה להתבונן על מסלול הזמן והפצה בתוך פרוסות של ביטוי חלבונים אקסוגני chimeric פלורסנט שהוצגו על ידי נגיפים שונים. אנחנו ואז לנצל את הביטוי הספציפי עצביים של מבנה הכתב cofilin לעקוב אחר ההתפתחות של cofilin רוד, פתולוגיה צבירה בפרוסות בהיפוקמפוס בתגובה לטיפול עם Aβ מסיסים oligomers (Aβ_o).