Wir beschreiben eine Methode für die hierbei geführte Lage, Belichtung und Abtragung des auditorischen Kortex bei Ratten. Die Lokalisierung der Ablation wird anhand eine Koordinate Karte Obduktion.
Die Ratte auditorischen Kortex (AC) wird immer beliebter unter auditiven Neurowissenschaften Ermittler, die Erfahrung-Abhängigkeit Plastizität, auditive Wahrnehmungs-Prozesse und kortikale Kontrolle über Sound-Bearbeitung in den subkortikalen auditiven Kernen interessiert sind. Bewältigung neuer Herausforderungen, ein Verfahren, um genau zu lokalisieren und chirurgisch Expose auditorischen Kortex würde dieser Forschungsanstrengungen zu beschleunigen. Stereotaktische Neurochirurgie wird routinemäßig in der präklinischen Forschung im Tiermodell verwendet, um weiterhin eine Nadel oder Elektrode an einer vordefinierten Position im auditorischen Kortex. In das folgende Protokoll verwenden wir stereotaktische Methoden auf neuartige Weise. Wir identifizieren vier Koordinatenpunkte über die Oberfläche des Temporal bone der Ratte ein Fenster definieren, die nach dem Öffnen genau sowohl die primäre (A1 macht) und sekundäre (Dorsal und Ventral) Cortex des AC mit dieser Methode, führen wir dann eine chirurgische Ablation der AC. Nachdem eine solche Manipulation durchgeführt wird, ist es zu prüfen, die Lokalisation, Größe und Ausdehnung der Läsionen im Kortex gemacht. So beschreiben wir auch eine Methode zum Auffinden der AC Ablation Obduktion eine Koordinate Parkplan konstruiert durch die Cytoarchitectural Grenzen des AC auf der Oberfläche des Gehirns zu übertragen. Die Kombination aus Lage hierbei geführt und Ablation des AC bei der Lokalisierung der verletzte Bereich in eine Obduktion koordinieren Karte erleichtert die Überprüfung von Informationen, die vom Tier und führt zu einer besseren Analyse und Verständnis der Daten.
Die Ratte ist eines der am häufigsten verwendeten tierischen Modelle in den auditiven Neurowissenschaften. Die Robustheit der sein Verhalten macht es für Hunderte von Studien pro Tag arbeiten. Seine Sensibilität und spektrale Schärfe für Anhörung1,2und der anatomischen und funktionellen Organisation des zentralen Systems, vergleichbar mit anderen Säugetieren3, machen der Ratte einen geeigneten Tiermodell für die Analyse von einer Vielzahl von Forschungsthemen im auditiven Neurowissenschaften. Die Ratte auditorischen Kortex (AC), wurde vor allem Gegenstand mehrere anatomische und physiologische Untersuchungen, die versucht haben, zu verstehen, seine Struktur, Organisation und Rolle bei der Tonbearbeitung3. Heute hat der AC beliebt unter Neurowissenschaftlern Erfahrung-Abhängigkeit Plastizität, auditive Wahrnehmung, die synaptischen Grundlage der rezeptiven Feldorganisation und die kortikale Kontrolle der Klangbearbeitung in die subkortikale auditive interessiert Kerne4,5,6,7,8,9. Zur Bewältigung der Herausforderungen, die diese neuen Ansätze darstellen, werden Verfahren, die genau zu lokalisieren und chirurgisch aussetzen der AC können Forschungsbemühungen beschleunigen. Stereotaktische Techniken machen es einfach, bestimmte Regionen im Gehirn ohne Physiologie Tests zu lokalisieren. Obwohl die Größe des Gehirns leicht variiert zwischen Tieren, kann von jedem Bereich des Gehirns ermittelt werden, wo mit stereotaktischen Koordinaten festlegen von Sehenswürdigkeiten auf den Schädel des Gehirns Ratte.
Die eingeschränkte Ablation des AC ist die chirurgische Entfernung der sensorischen Region der Hirnrinde, die unmittelbar im Zusammenhang mit dem Gehör. Im Gegensatz zu anderen Methoden verwendet, um die Aktivität des AC, wie z. B. Kühl- oder lokale Lidocain-Injektionen10,11,12, die chirurgische Ablation der AC Ergebnisse in den chronischen Verlust der Funktion blockieren. Damit eignen sich AC Ablationen mehr für das Studium, die langfristigen Auswirkungen der kortikalen Entbehrung, sowie die anschließende Phänomene der Läsion Plastizität. Die Kombination von stereotaktischen Methoden mit chirurgischen Ablationen des AC hat erfolgreich zur Untersuchung der physiologischen, Verhaltens- und molekularen Auswirkungen der kortikalen Kontrolle Entbehrung13,14,15 ,16,17,18,19. Zum Beispiel wurde einem Rattenmodell mit bilateralen AC Ablationen zur Untersuchung der Auswirkungen der kortikalen Ablation im auditiven Startle Reflex und auditory Brainstem Antworten (ABR)16. Vor kurzem haben wir die Auswirkungen, dass einseitige gegenüber bilateralen Ablationen Ratte AC Produkte in ABR Schwellen, Amplituden und Latenzen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verletzung18verglichen. Darüber hinaus hat Rattenmodell der restriktiven AC Ablation auch verwendet worden, die Wirkung der Corticofugal Weg Degeneration in den minderwertigen Collicus13,14,15 und das Innenohr17 zu studieren ,19. Nachdem eine solche Manipulation im Gehirn durchgeführt wird, ist es zu prüfen, die Lokalisation, Größe und Ausdehnung der Läsionen im Kortex gemacht. Obwohl sehr nützlich, die wichtigste Einschränkung der tonotopen Karten basierend auf neuronalen Antworten20,21 sind die elektrophysiologischen Techniken erforderlich um den auditiven Bereichen im Rattengehirn zu suchen. Da nicht alle Labors haben die notwendige Ausrüstung und/oder Know-how, solche Aufnahmen zu machen, haben wir eine Koordinate Karte basierend auf die Übertragung der Cytoarchitectural Grenzen des AC zu einem Bild des Gehirns Oberfläche18. Diese Karte kann sehr nützlich, die AC ohne Physiologie Tests zu finden sein.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die hierbei geführten Lage, chirurgische Exposition und Abtragen des AC bei Ratten. Es beschreibt auch unsere Koordinaten Karte18 verwenden, um der Ausdehnung der Läsion über ein Bild von der Oberfläche der abgetragenen Köpfe leicht zu lokalisieren.
Eine erfolgreiche Gehirnchirurgie hängt von zwei Faktoren ab: das Tier am Leben zu halten, während und nach dem Eingriff und präzise Ortung den Bereich von Interesse. Um sicherzustellen, dass die Ratte ist tief während der Operation (Prüfung des Rücknahme-Reflexes) betäubt, und erhält ausreichend Analgetika und nicht-ototoxische Antibiotika sollte überleben helfen. Darüber hinaus sollte die Ratte auf ein Heizkissen gehalten werden, bis es aus der Narkose wacht um Unterkühlung zu vermeiden. Vernähen verringert sich die Anfälligkeit für Infektionen, und richtige Technik ist wichtig: Tiere holen ihre Wunde Clips, so dass sie fest genug implantiert werden sollte, um zu entfernen ohne dabei zu viel Spannung auf die Wunde zu verhindern.
Zu den AC (oder irgendeinem anderen kortikalen Bereich), genau zu lokalisieren ist wichtig zur Positionsbestimmung von Bregma, Lambda und interaural 0 bis sie als Referenz verwenden, um die Grenzen der Region gezielt zu berechnen. Jeder Fehler bei der Berechnung der Koordinaten führt die teilweise Abtragung des AC oder unerwünschte Aspiration von anderen umliegenden Gebieten. So sollte die Nadelspitze berühren nur die Knochen bei interaural 0 und dann übersetzen die Antero-posterioren und Medio-lateralen Koordinaten entsprechend, was in diesem Protokoll beschrieben ist.
In dieser Handschrift haben wir auch beschrieben, wie Sie chirurgisch freizulegen und Abtragen der AC. Es gibt drei wichtige Schritte: der Bohrvorgang, die Öffnung und Entfernung von der Hirnhaut und die Ablation durch Absaugen. Bohren sollte bei niedriger Drehzahl mit minimaler Druck durchgeführt werden, da eine hohe Bohrgeschwindigkeit Wärme erzeugt, die in der Nähe subkortikalen Strukturen beeinflussen können. Jedoch sollten Beibehaltung einer niedrigen Geschwindigkeit und Bohren Kühlbereich mit kalt sterile Kochsalzlösung eine Beschädigung vermeiden. Darüber hinaus ist Mindestdruck unbedingt zu einen plötzlichen Bruch des Schädels und spätere Verletzungen der zugrunde liegenden Kortex zu vermeiden. Die Öffnung und Entfernung von der Hirnhaut, die die AC abdecken sollte sorgfältig durchgeführt werden, um zu vermeiden, die Blutgefäße zu brechen. Wenn Blutungen auftreten, die frühe und späte Prognose ist im allgemeinen ungünstig und es ist fraglich, ob so ein Tier die Einschlusskriterien für eine zuverlässige Studie entspricht. Wir empfehlen in diesem Fall Euthanasie. Schließlich muss die Aspiration (wahrscheinlich der schwierigste Aspekt bei der Durchführung einer effektiven Läsion), auf die graue Substanz beschränkt. Es gibt zwei Indikatoren, die helfen können das Vorhandensein der weißen Substanz: (1) eine Änderung der Farbkontrast, als die weiße Substanz ist heller als die graue Substanz; (2) die Beendigung von Blutungen aus den perforierende Arterien.
Nachdem jede Manipulation im Gehirn durchgeführt, ist es notwendig, die Lokalisation, Größe und Ausdehnung des Verfahrens gemacht in der Hirnrinde für die anschließende Analyse und Validierung von Daten, die vom Tier zu beurteilen. In dieser Handschrift die, ausführlich wir die Ablation durchgeführt in der Hirnrinde mit Hilfe einer Koordinaten Karte zuvor beschrieben durch unsere Gruppe18Lokalisierung. Diese Karte wurde gebaut mit anatomischen Referenzen aus seriellen Abschnitt Rekonstruktionen der histologischen Abschnitte, korreliert mit dem Paxinos und Watson Atlas der Ratte Gehirn22gewonnen. Dementsprechend unterscheidet die Karte zwischen den primären (A1) und sekundäre Rinde (Dorsal und Ventral) des AC. Der Hauptvorteil dieser Koordinaten Karte ist, dass es die schnelle Lokalisierung der Läsion ermöglicht durch die Überlagerung ein Bild aus der Mantelfläche des Gehirns in eine sagittale Gehirn Matrix platziert. Ein weiterer Vorteil ist, dass Labore mit weniger Erfahrung in der Anatomie die Karte verwenden können, durch Anpassung an ihre Tiermodelle. Es ist nur notwendig, die Abstände zwischen Bregma, Lambda und interaural 0 Referenzen in ein Steuerelement durchblutet Gehirn und Skalieren der Karte oben oder unten entsprechend. Verwenden Sie der Rhinal Riss als Referenz, das Bild des Gehirns auf der Karte anpassen. Die Tiefe der Ablation kann nicht in dieser Koordinaten Karte bestimmt werden, so dass es im Gehirn histologischen Abschnitte bestimmt werden sollte.
Die Kombination von stereotaktischen Methoden mit der chirurgischen Exposition des AC sind grundlegende Methoden, die leicht von jedem Ermittler angepasst werden könnte, möchte das AC bei der Ratte zu richten. Dies wäre für ein akutes Experiment oder der Implantation von permanenten Geräte erfordert. Darüber hinaus wurde die chirurgische Ablation des AC zuvor als Vorbild verwendet Studie zu den Auswirkungen der chronischen kortikalen Deprivation in Verhandlung. AC Ablationen könnte auch verwendet werden, um die Effekte zu studieren, die einseitige AC Ablationen in anderen kortikalen Bereichen ausüben, oder dienen als ein Modell eines Schlaganfalls. Die hier beschriebenen Versuchsanordnungen sind hilfreiche Methoden, die einzeln oder in Kombination mit einer Vielzahl von experimentellen Designs angewendet werden können.
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit (MINECO) der spanischen Regierung, SAF2016-78898-C2-2-R.
Stereotaxic frame | David Kopf Ins. | 900 | |
Surgical microscope | WILD M650 Heerbrugg | ||
Heating pad | DAGA | ||
Dental micromotor | W&H elco | 5118 | |
Diamond burr | B Braun | GD021R | 0.6 mm |
Surgical suction device | Atmos | Atmoforte E2 | |
Ketamine | Merial | 30 mg/kg | |
Xylazine | Bayer | 5 mg/kg | |
Micromanipulator | Narishige | SM-11 | |
Scalpel | Lawton | ||
Povidone iodine | Meda | Betadine | |
sterile saline serum | B.Braun | ||
20G sterile needle | Terumo Neolus | ||
Cotton tips | |||
Suture material | B.Braun | ||
Antibiotic Ointment | Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) – Schering-Plough | ||
Forceps | dimeda | 10.331.12 | |
Surgical needles | World Precision Instruments | 501940 | |
Buprenorphine | Indivior UK | Buprex | 0.01-0.05 mg/kg |
Scissor | dimeda | 08.120.15 | |
Spencer scissor | dimeda | 08.804.14 | |
Rongeurs | Lawton | ||
Microsurgical knife | MSP | 7503 | |
Absorbable hemostatic gauze | Surgicel | ||
Saggital rat Brain Matrix | Activational systems Inc. | RBM-1000DV / RBM 4000C | |
Sodium pentobarbital | Vetoquinol | 0.1 mL | |
Camera | Olympus 5.1 MP | C-5060 wide zoom | lens F2.8-4.8 |
Wound clips | Reflex 9 | 9 mm | |
Canvas 12 | ACD Systems | ||
needle gauge | diameter 1.8 mm | ||
Separatory funnel | labbox | 11409 | 500 mL |
GluA2 primer Forward | GeneBank | NM_017261 | CGGCAGCTCAGCTAAAAACT |
GluA2 primer Reverse | GeneBank | NM_017261 | TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA |
GluA3 primer Forward | GeneBank | NM_032990 | ATTGCTGATGGTGCAATGAC |
GluA3 primer Reverse | GeneBank | NM_032990 | TTTGCATTGTCGCAAGTCTC |