Descriviamo un metodo per la posizione stereotactically-guida, l’esposizione e l’ablazione della corteccia uditiva in ratti. La localizzazione dell’ablazione è valutata usando un post mortem delle coordinate mappa.
La corteccia uditiva di ratto (AC) sta diventando popolare tra gli investigatori di neuroscienze uditiva che sono interessati a plasticità esperienza-dipendenza, processi percettivi uditivi e controllo corticale di elaborazione nei nuclei uditivi subcorticali del suono. Per affrontare nuove sfide, una procedura per individuare con precisione e chirurgicamente esporre la corteccia uditiva sarebbe accelerare questo sforzo di ricerca. Neurochirurgia stereotassica è usata ordinariamente in ricerca pre-clinica in modelli animali per attecchire un ago o un elettrodo ad una posizione pre-definita all’interno della corteccia uditiva. Nel protocollo seguente, usiamo metodi stereotactic in modo inedito. Identifichiamo i quattro punti di coordinate sulla superficie del temporal bone del ratto per definire una finestra che, una volta aperto, accuratamente espone sia il primario (A1) e secondario (dorsale e ventrale) cortecce del AC. utilizzando questo metodo, quindi eseguiamo un chirurgico ablazione di AC. Dopo una tale manipolazione viene eseguita, è necessario valutare la localizzazione, la dimensione e l’estensione delle lesioni fatta nella corteccia. Così, inoltre descriviamo un metodo per individuare facilmente l’autopsia di ablazione AC utilizzando una mappa delle coordinate costruita trasferendo i limiti cytoarchitectural di AC alla superficie del cervello. La combinazione della posizione stereotactically-guida e l’ablazione di AC con la localizzazione della zona danneggiata in un post mortem delle coordinate mappa facilita la convalida delle informazioni ottenute dall’animale e conduce ad una migliore analisi e comprensione dei dati.
Il ratto è uno dei modelli animali più comunemente usati in neuroscienze uditiva. La robustezza del suo comportamento lo rende in grado di lavorare per centinaia di prove al giorno. La sua sensibilità e acutezza spettrale per udienza1,2e l’organizzazione anatomica e funzionale del suo sistema centrale, paragonabile ad altri mammiferi3, fare il topo un modello animale adatto per analizzare una vasta gamma di temi di ricerca in neuroscienze uditiva. La corteccia uditiva di ratto (AC), in particolare, è stato oggetto di numerosi studi anatomici e fisiologici che hanno cercato di capire la sua struttura, organizzazione e ruolo nell’elaborazione del suono3. Oggi, l’AC è diventato popolare tra i neuroscienziati interessati a plasticità esperienza-dipendenza, percezione uditiva, la base sinaptica dell’organizzazione del campo recettivo e del controllo corticale dell’elaborazione del suono nel subcortical uditivo i nuclei4,5,6,7,8,9. Per affrontare le sfide che pongono questi nuovi approcci, procedure che possono individuare con precisione ed esporre chirurgicamente l’AC accelerare gli sforzi di ricerca. Stereotactic tecniche lo rendono facile da localizzare specifiche regioni all’interno del cervello senza test di fisiologia. Anche se le dimensioni del cervello varia leggermente tra gli animali, la posizione di ogni area del cervello può essere determinata utilizzando le coordinate stereotactic impostato da punti di riferimento sul cranio del cervello del ratto.
L’ablazione con restrizioni di AC è la rimozione chirurgica della regione sensoriale della corteccia più direttamente correlata con problemi di udito. A differenza di altri metodi utilizzati per bloccare l’attività di AC, come raffreddamento o locale lidocaina iniezioni10,11,12, l’ablazione chirurgica dei risultati AC la cronica perdita di funzione. Così, ablazioni AC sono più adatti per studiare gli effetti a lungo termine della privazione corticale, così come i successivi fenomeni di plasticità di lesione. La combinazione di metodi stereotactic con ablazioni chirurgiche di AC è stata utilizzata con successo per studiare gli effetti fisiologici, comportamentali e molecolari del controllo corticale privazione13,14,15 ,16,17,18,19. Ad esempio, un modello del ratto con ablazioni AC bilaterale è stato utilizzato per studiare gli effetti dell’ablazione corticale nel riflesso dello startle uditiva e uditive del tronco cerebrale (ABR) risposte16. Recentemente, abbiamo confrontato gli effetti che unilaterali contro bilaterale ablazioni dei prodotti del ratto AC in soglie ABR, ampiezze e latenze in diversi momenti dopo l’ infortunio18. Inoltre, il modello del ratto di ablazione AC restrittiva è stato utilizzato anche per studiare l’effetto di degenerazione di via corticofugal le inferiori collicus13,14,15 e l’ orecchio interno17 ,19. Dopo una tale manipolazione avviene nel cervello, è necessario valutare la localizzazione, la dimensione e l’estensione delle lesioni fatta nella corteccia. Anche se molto utile, la principale limitazione di tonotopico mappe basate su risposte neuronali20,21 sono le tecniche elettrofisiologiche necessarie per individuare i campi uditivi nel cervello del ratto. Poiché non tutti i laboratori hanno l’attrezzatura necessaria e/o perizia per fare tali registrazioni, abbiamo costruito una mappa delle coordinate basata sul trasferimento dei limiti cytoarchitectural di AC a un’immagine della superficie del cervello18. Questa mappa può essere molto utile per individuare l’AC senza test di fisiologia.
Il presente protocollo descrive un metodo per la posizione stereotactically guidate, l’esposizione chirurgica e ablazione di AC in ratti. Viene inoltre descritto come utilizzare la nostra mappa delle coordinate18 per localizzare facilmente l’estensione della lesione sopra un’immagine della superficie dei cervelli ablati.
Un intervento chirurgico al cervello successo dipende da due fattori: mantenere l’animale vivo durante e dopo la procedura e localizzare con precisione l’area di interesse. Garantire che il ratto è anestetizzato durante l’intervento (test del riflesso di ritiro) e riceve un’adeguata analgesici e antibiotici non ototossici dovrebbero aiutare la sopravvivenza. Il ratto, inoltre, dovrebbe essere tenuto su un rilievo di riscaldamento fino a quando si sveglia dall’anestesia per evitare l’ipotermia. Sutura farà diminuire la suscettibilità all’infezione, e la tecnica corretta è fondamentale: gli animali vi verrà a prendere al loro clips di ferita, così che deve essere impiantati abbastanza stretto per impedire la rimozione senza porre troppa tensione sulla ferita.
Per individuare con precisione l’AC (o qualsiasi altra area corticale), è importante determinare la posizione di bregma, lambda e interaural 0 a utilizzarli come riferimenti per calcolare i limiti della regione di destinazione. Qualsiasi errore nel calcolo delle coordinate comporterà l’ablazione parziale di AC o l’aspirazione indesiderato di altre zone circostanti. Così, la punta dell’ago deve solo toccare l’osso a interaural 0 e poi tradurre le coordinate antero-posteriore e medio-laterale secondo ciò che è descritto in questo protocollo.
In questo manoscritto, abbiamo anche descritto come chirurgicamente esporre e l’ablazione l’AC. Ci sono tre fasi critiche: il processo di perforazione, l’apertura e la rimozione di meningi e l’ablazione di aspirazione. Foratura deve essere eseguito a bassa velocità con pressione minima, come un’alta velocità di perforazione genera calore che può interessare è vicino a strutture subcortical. Tuttavia, mantenere una bassa velocità e punto di foratura con soluzione salina sterile fredda di raffreddamento dovrebbe impedire eventuali danni. Inoltre, la pressione minima è essenziale per evitare una rottura improvvisa del cranio e del conseguente pregiudizio alla corteccia sottostante. L’apertura e la rimozione delle meningi che coprono l’AC deve essere eseguite con attenzione per evitare la rottura dei vasi sanguigni. Se il sanguinamento si verifica, la prognosi precoce e tardiva è generalmente sfavorevole ed è lecito chiedersi se tale animale soddisfa i criteri di inclusione per uno studio affidabile. Si consiglia in questo caso l’eutanasia. Infine, l’aspirazione (probabilmente l’aspetto più difficile nell’esecuzione di un’effettiva lesione), deve essere limitato alla materia grigia. Ci sono due indicatori che consentono di rilevare la presenza della materia bianca: (1) un cambiamento in contrasto di colore, come la materia bianca è più luminoso rispetto alla materia grigia; e (2) la cessazione del sanguinamento dalle arterie perforanti.
Dopo qualsiasi manipolazione eseguita nel cervello, è necessario valutare la localizzazione, la dimensione e l’estensione della procedura effettuata nella corteccia per la successiva analisi e validazione dei dati ottenuti dall’animale. In questo manoscritto, dettagliamo come localizzare l’ablazione eseguita nella corteccia usando una mappa delle coordinate precedentemente descritta dal nostro gruppo di18. Questa mappa è stata costruita utilizzando riferimenti anatomici ottenuti dalle ricostruzioni sezione seriale delle sezioni istologiche, correlate con l’Atlante Paxinos e Watson del cervello del ratto22. Di conseguenza, la mappa differenzia fra il primario (A1) e cortecce secondarie (dorsale e ventrale) di AC. Il vantaggio principale di questa mappa delle coordinate è che permette la rapida localizzazione della lesione sovrapponendo una foto scattata dalla superficie laterale del cervello inserito in una matrice sagittale del cervello. Un altro vantaggio è che i laboratori con meno esperienza in anatomia possono utilizzare la mappa adattandola ai loro modelli animali. Solo è necessario impostare le distanze tra bregma, lambda e interaural 0 riferimenti in un cervello di controllo irrorato e ridimensionare la mappa verso l’alto o verso il basso di conseguenza. Utilizzare la fessura Rhinal come riferimento per regolare l’immagine del cervello alla mappa. La profondità dell’ablazione non può essere determinata in questa mappa delle coordinate, così dovrebbe essere determinato nelle sezioni istologiche del cervello.
La combinazione di metodi stereotactic con l’esposizione chirurgica dell’AC sono metodi di base che potrebbero essere facilmente adattati da qualsiasi ricercatore che vuole indirizzare l’AC nel ratto. Questo potrebbe essere per un esperimento acuto o uno che richiede l’impianto di dispositivi permanenti. Inoltre, l’ablazione chirurgica di AC è stato precedentemente utilizzato come modello per studiare gli effetti di privazione cronica corticale in udienza. Ablazioni AC potrebbero essere utilizzati anche per studiare gli effetti che ablazioni unilaterali di AC esercitano in altre aree corticali, o servono come un modello del colpo. Così, i disegni sperimentali descritti qui sono metodi utili che possono essere applicate singolarmente o in combinazione ad una vasta gamma di disegni sperimentali.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione del Ministero dell’economia e competitività (MINECO) del governo di Spagna, SAF2016-78898-C2-2-R.
Stereotaxic frame | David Kopf Ins. | 900 | |
Surgical microscope | WILD M650 Heerbrugg | ||
Heating pad | DAGA | ||
Dental micromotor | W&H elco | 5118 | |
Diamond burr | B Braun | GD021R | 0.6 mm |
Surgical suction device | Atmos | Atmoforte E2 | |
Ketamine | Merial | 30 mg/kg | |
Xylazine | Bayer | 5 mg/kg | |
Micromanipulator | Narishige | SM-11 | |
Scalpel | Lawton | ||
Povidone iodine | Meda | Betadine | |
sterile saline serum | B.Braun | ||
20G sterile needle | Terumo Neolus | ||
Cotton tips | |||
Suture material | B.Braun | ||
Antibiotic Ointment | Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) – Schering-Plough | ||
Forceps | dimeda | 10.331.12 | |
Surgical needles | World Precision Instruments | 501940 | |
Buprenorphine | Indivior UK | Buprex | 0.01-0.05 mg/kg |
Scissor | dimeda | 08.120.15 | |
Spencer scissor | dimeda | 08.804.14 | |
Rongeurs | Lawton | ||
Microsurgical knife | MSP | 7503 | |
Absorbable hemostatic gauze | Surgicel | ||
Saggital rat Brain Matrix | Activational systems Inc. | RBM-1000DV / RBM 4000C | |
Sodium pentobarbital | Vetoquinol | 0.1 mL | |
Camera | Olympus 5.1 MP | C-5060 wide zoom | lens F2.8-4.8 |
Wound clips | Reflex 9 | 9 mm | |
Canvas 12 | ACD Systems | ||
needle gauge | diameter 1.8 mm | ||
Separatory funnel | labbox | 11409 | 500 mL |
GluA2 primer Forward | GeneBank | NM_017261 | CGGCAGCTCAGCTAAAAACT |
GluA2 primer Reverse | GeneBank | NM_017261 | TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA |
GluA3 primer Forward | GeneBank | NM_032990 | ATTGCTGATGGTGCAATGAC |
GluA3 primer Reverse | GeneBank | NM_032990 | TTTGCATTGTCGCAAGTCTC |