Nous décrivons une méthode pour l’emplacement de stereotactically guidée, l’exposition et ablation du cortex auditif chez les rats. La localisation de l’ablation est évaluée à l’aide d’un post-mortem carte coordonnée.
Le cortex auditif de rat (AC) est plus populaire parmi les enquêteurs neuroscience auditif qui s’intéressent à la plasticité de l’expérience-dépendance des processus perceptifs auditifs et contrôle cortical du son traitement dans les noyaux sous-corticaux auditifs. Pour aborder de nouveaux défis, une procédure pour localiser avec précision et chirurgicalement exposer le cortex auditif hâterait cet effort de recherche. Neurochirurgie stéréotaxique est régulièrement utilisée dans la recherche préclinique chez des modèles animaux pour greffer une aiguille ou une électrode à un emplacement prédéfini dans le cortex auditif. Dans le protocole suivant, nous utilisons des méthodes stéréotaxiques d’une nouvelle façon. Nous identifions les quatre points de coordonnées sur la surface de la temporal bone du rat pour définir une fenêtre qui, une fois ouvert, expose avec précision les fois le primaire (A1) et secondaire cortex (dorsale et ventrale) de l’AC à l’aide de cette méthode, nous effectuons ensuite une chirurgie ablation de l’AC. Après qu’une telle manipulation ne soit effectuée, il est nécessaire d’évaluer la localisation, la taille et l’extension des lésions dans le cortex. Ainsi, on décrit également une méthode pour localiser facilement le post-mortem AC ablation à l’aide d’une carte coordonnée construite en transférant les limites de la cytoarchitecturaux du Comité d’audit sur la surface du cerveau. La combinaison de l’emplacement de stereotactically guidée et l’ablation de l’AC avec la localisation de la zone lésée en un post mortem carte coordonnée facilite la validation de l’information provenant de l’animal et conduit à une meilleure analyse et compréhension des données.
Le rat est un des modèles animaux plus couramment utilisés en neurosciences auditif. La robustesse de son comportement le rend capable de travailler pendant des centaines d’essais par jour. Sa sensibilité et son acuité spectrale pour audience1,2et l’Organisation anatomique et fonctionnelle de son système central, comparable aux autres mammifères3, faire le rat un modèle animal approprié permettant d’analyser un large éventail de thèmes de recherche en neurosciences auditif. Le cortex auditif de rat (AC), en particulier, a fait l’objet de plusieurs études anatomiques et physiologiques qui ont tenté de comprendre sa structure, organisation et rôle dans le traitement du son3. De nos jours, le commandant de bord est devenu populaire parmi neuroscientifiques intéressés de la plasticité de l’expérience-dépendance, perception auditive, les fondements synaptique de champ réceptif organisation et le contrôle cortical du traitement sonore dans le sous-corticale auditif noyaux4,5,6,7,8,9. Pour relever les défis que posent ces nouvelles approches, procédures qui peuvent localiser avec précision et chirurgicalement exposer l’AC accélérera les efforts de recherche. Stéréotaxiques techniques le rendent facile à localiser les régions spécifiques dans le cerveau sans essai de physiologie. Bien que la taille du cerveau varie légèrement entre les animaux, l’emplacement de n’importe quel secteur de cerveau peut être déterminé à l’aide de coordonnées stéréotaxiques, définir des points de repère sur le crâne, le cerveau de rat.
L’ablation restreinte du Comité d’audit est l’ablation chirurgicale de la région sensorielle du cortex plus directement liée à l’audience. Contrairement aux autres méthodes utilisées pour bloquer l’activité du Comité d’audit, telles que le refroidissement ou locale lidocaïne injections10,11,12, l’ablation chirurgicale des résultats AC la perte chronique de fonction. Ainsi, les ablations AC conviennent mieux pour étudier les effets à long terme de privation corticale, ainsi que les phénomènes ultérieurs de la plasticité de la lésion. La combinaison des méthodes stéréotaxiques avec ablation chirurgicale du Comité d’audit a été utilisée avec succès pour étudier les effets physiologiques, comportements et moléculaires du contrôle cortical privation13,14,15 ,16,17,18,19. Par exemple, un modèle de rat avec ablation bilatérale de AC a été utilisé pour étudier les effets de l’ablation corticale dans le réflexe de sursaut auditif et auditif du tronc cérébral (PEATC) les réponses16. Récemment, nous avons comparé les effets qu’unilatérales contre ablation bilatérale du rat AC produit dans les seuils de l’ABR, amplitudes et latences à des moments différents après la blessure de18. En outre, le modèle de rat de l’ablation AC restrictive a également servi à étudier les effets de la dégénérescence voie corticofugal dans les collicus inférieurs13,14,15 et l’oreille interne17 ,19. Après qu’une telle manipulation est effectuée dans le cerveau, il est nécessaire d’évaluer la localisation, la taille et l’extension des lésions dans le cortex. Bien que très utile, la principale limitation de cartes tonotopique issu des réponses neuronales20,21 sont les techniques électrophysiologiques nécessaires pour localiser les domaines auditifs dans le cerveau de rat. Pas tous les laboratoires ayant des équipements nécessaires ou des compétences pour faire ces enregistrements, nous avons construit une carte coordonnée fondée sur le transfert des limites cytoarchitecturaux du Comité d’audit à une image de la surface du cerveau18. Cette carte peut être très utile pour localiser l’AC sans essai de physiologie.
Le présent protocole décrit une méthode pour l’emplacement stereotactically guidée, exposition chirurgicale et ablation de l’AC chez les rats. Il décrit également comment utiliser nos coordonnées carte18 de localiser facilement l’extension de la lésion sur une image de la surface des cerveaux ramollis.
Une chirurgie du cerveau réussie dépend de deux facteurs : maintenir l’animal en vie pendant et après la procédure et de localiser avec précision la zone d’intérêt. Veiller à ce que le rat est profondément anesthésié au cours de la chirurgie (test du réflexe de retrait) et reçoit des analgésiques adéquates et antibiotiques non ototoxiques devraient contribuer à la survie. En outre, le rat doit être conservé sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’il se réveille de l’anesthésie pour éviter l’hypothermie. Suture diminuera la sensibilité aux infections, et une bonne technique est vitale : animaux viendra chercher à leurs clips de plaie, donc ils doivent être implantés assez serré pour empêcher la suppression sans mettre trop de tension sur la plaie.
Pour localiser avec précision l’AC (ou toute autre zone corticale), il est important de déterminer la position du bregma, lambda et 0 interaural de les utiliser comme références pour calculer les limites de la région ciblée. Toute erreur dans le calcul des coordonnées entraînera l’ablation partielle de l’AC ou l’aspiration intempestif des autres régions avoisinantes. Ainsi, la pointe de l’aiguille devrait toucher uniquement l’os à 0 interaural et puis traduire les coordonnées antéro-postérieure et médiolatérales selon ce qui est décrit dans le présent protocole.
Dans ce manuscrit, nous avons également décrit comment chirurgicalement exposer et l’ablation de l’AC. Il y a trois étapes cruciales : le processus de forage, l’ouverture et l’élimination des méninges et l’ablation par aspiration. De forage doit être effectuée à basse vitesse avec une pression minimale, comme une vitesse de forage élevée génère de la chaleur qui peut affecter à proximité de structures sous-corticales. Cependant, maintenir une vitesse faible et le refroidissement de la zone de forage avec du sérum physiologique stérile froide devraient empêcher tout dommage. En outre, la pression minimale est indispensable pour éviter une rupture brutale du crâne et du préjudice en résultant pour le cortex sous-jacent. L’ouverture et le retrait des méninges qui couvrent l’AC doivent être effectuées avec précaution pour éviter d’interrompre les vaisseaux sanguins. Si le saignement se produit, le pronostic précoce et tardif est généralement défavorable et on peut se demander si un tel animal répond aux critères d’admissibilité pour une étude fiable. Nous vous recommandons dans ce cas d’euthanasie. Enfin, l’aspiration (sans doute l’aspect plus difficile en effectuant une lésion apparente), doit être limitée à la matière grise. Il y a deux indicateurs qui peuvent aider à détecter la présence de la substance blanche : (1) un changement dans le contraste des couleurs, comme la substance blanche est plus lumineux que la matière grise ; et (2) la cessation des saignements des artères perforantes.
Après que toute manipulation effectuée dans le cerveau, il est nécessaire de déterminer la localisation, la taille et l’extension de la procédure dans le cortex pour l’analyse ultérieure et la validation des données provenant de l’animal. Dans ce manuscrit, nous détaillons la localisation de l’ablation effectuée dans le cortex en utilisant une carte coordonnée précédemment décrite par notre groupe18. Cette carte a été dressée à l’aide de références anatomiques obtenus à partir des reconstructions de sections sériées de coupes histologiques, en corrélation avec l’atlas Paxinos et Watson le cerveau de rat22. En conséquence, le plan établit une distinction entre le primaire (A1) et le cortex secondaires (dorsale et ventrale) de l’AC. Le principal avantage de cette carte coordonnée est qu’il permet la localisation rapide de la lésion en superposant une photo prise sur la surface latérale du cerveau placé dans une matrice de cerveau sagittale. Un autre avantage est que les laboratoires ayant moins d’expérience en anatomie peuvent utiliser la carte en l’adaptant à leurs modèles animaux. Il suffit de régler l’écartement du bregma, lambda et interaural 0 références dans un cerveau contrôle perfusé et l’évolution de la carte vers le haut ou vers le bas en conséquence. Utilisez la Fissure Rhinal comme référence pour ajuster l’image du cerveau à la carte. Impossible de déterminer la profondeur de l’ablation dans cette carte coordonnée, donc il doit être déterminée dans les coupes histologiques de cerveau.
La combinaison de méthodes stéréotaxiques avec l’exposition chirurgicale de l’AC sont des méthodes de base qui pourraient être facilement adaptés par n’importe quel chercheur qui souhaite cibler l’AC chez le rat. C’est peut-être pour une expérience aiguë ou qui exige l’implantation des dispositifs permanents. Par ailleurs, l’ablation chirurgicale de l’AC a servi auparavant comme un modèle pour étudier les effets de la privation chronique corticale en audience. Ablations AC pourraient également être utilisées pour étudier les effets qu’exercent dans d’autres régions corticales unilatérale ablation AC, ou service de modèle de course. Ainsi, les conceptions expérimentales décrites ici sont des méthodes utiles qui peuvent être appliquées individuellement ou en association à un large éventail de modèles expérimentaux.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été financée par une subvention par le ministère de l’économie et la compétitivité (MINECO) du gouvernement de l’Espagne, SAF2016-78898-C2-2-R.
Stereotaxic frame | David Kopf Ins. | 900 | |
Surgical microscope | WILD M650 Heerbrugg | ||
Heating pad | DAGA | ||
Dental micromotor | W&H elco | 5118 | |
Diamond burr | B Braun | GD021R | 0.6 mm |
Surgical suction device | Atmos | Atmoforte E2 | |
Ketamine | Merial | 30 mg/kg | |
Xylazine | Bayer | 5 mg/kg | |
Micromanipulator | Narishige | SM-11 | |
Scalpel | Lawton | ||
Povidone iodine | Meda | Betadine | |
sterile saline serum | B.Braun | ||
20G sterile needle | Terumo Neolus | ||
Cotton tips | |||
Suture material | B.Braun | ||
Antibiotic Ointment | Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) – Schering-Plough | ||
Forceps | dimeda | 10.331.12 | |
Surgical needles | World Precision Instruments | 501940 | |
Buprenorphine | Indivior UK | Buprex | 0.01-0.05 mg/kg |
Scissor | dimeda | 08.120.15 | |
Spencer scissor | dimeda | 08.804.14 | |
Rongeurs | Lawton | ||
Microsurgical knife | MSP | 7503 | |
Absorbable hemostatic gauze | Surgicel | ||
Saggital rat Brain Matrix | Activational systems Inc. | RBM-1000DV / RBM 4000C | |
Sodium pentobarbital | Vetoquinol | 0.1 mL | |
Camera | Olympus 5.1 MP | C-5060 wide zoom | lens F2.8-4.8 |
Wound clips | Reflex 9 | 9 mm | |
Canvas 12 | ACD Systems | ||
needle gauge | diameter 1.8 mm | ||
Separatory funnel | labbox | 11409 | 500 mL |
GluA2 primer Forward | GeneBank | NM_017261 | CGGCAGCTCAGCTAAAAACT |
GluA2 primer Reverse | GeneBank | NM_017261 | TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA |
GluA3 primer Forward | GeneBank | NM_032990 | ATTGCTGATGGTGCAATGAC |
GluA3 primer Reverse | GeneBank | NM_032990 | TTTGCATTGTCGCAAGTCTC |