Мы описываем метод вентрикуло руководствуясь местоположения, экспозиции и абляции аудиального кортекса у крыс. Локализация абляции оценивается с помощью координат карты посмертных.
Крыса аудиального кортекса (AC) становится популярным среди слуховой нейронауки следователей, которые заинтересованы в опыт зависимость пластичности, слухового восприятия процессов и коркового контроля звука обработка в подкорковых слуховых ядер. Для решения новых проблем, процедура точно найти и хирургическим путем разоблачения аудиальном кортексе ускорит этот исследовательских усилий. Стереотаксическая нейрохирургия обычно используется в доклинических исследованиях на животных моделях привить иглы или электрода на предварительно определенное место в аудиальном кортексе. В следующий протокол мы используем методы стереотаксической Роман способом. Мы определить четыре координат точки на поверхности temporal bone крыса определить окно, предоставляющий, после вскрытия, точно как основной (A1) и вторичные (спинной и брюшной) коре AC., используя этот метод, мы затем выполнить хирургический Аблация переменного тока. После таких манипуляций, необходимо оценить локализации, размера и расширение поражений в коре головного мозга. Таким образом мы также описывают метод легко найти посмертных абляции переменного тока, с помощью координат карты построены путем передачи cytoarchitectural пределы переменного тока на поверхности мозга. Сочетание вентрикуло руководствуясь местоположения и абляции переменного тока с локализацией травмированного участка в посмертных координат карты облегчает проверку информации, полученной от животного и приводит к более обстоятельного анализа и понимание данных.
Крыса является одним из наиболее часто используемых животных моделей в слуховой нейронауки. Надежность его поведение делает его способным работать для сотен судебных разбирательств в день. Его чувствительность и спектральные острота слуха1,2, и анатомической и функциональной организации своей центральной системы, сопоставима с других млекопитающих3, делают крыса подходящей животной модели для анализа широкий спектр темы исследований в слуховой нейронауки. Крыса аудиального кортекса (AC), в частности, был предметом нескольких анатомических и физиологических исследований, которые пытались понять его структура, Организация и роль в обработки звука3. В настоящее время стала популярной среди неврологи интересует опыт зависимость пластичности, слухового восприятия, синаптических основы организации восприимчивы поля и коркового контроля обработки звука в подкорковых слуховой переменного тока ядер4,5,6,,78,9. Для решения проблем, которые создают эти новые подходы, процедуры, которые могут точно найти и хирургическим разоблачить AC ускорит исследовательские усилия. Стереотаксические методики позволяют легко локализовать без физиологии тестирование конкретных регионов в головном мозге. Хотя размер мозга слегка варьируется между животными, местоположение любой области мозга может быть установлено с помощью стереотаксических координат набор из достопримечательностей на череп мозга крысы.
Ограниченные абляции переменного тока является хирургическое удаление регионе сенсорной коры, самым непосредственным образом связаны с слуха. В отличие от других методов, используемых для блокирования деятельности переменного тока, такие как охлаждение или местные лидокаина инъекции10,11,12, хирургической аблации переменного тока результаты в хронические потери функции. Таким образом AC аблаций больше подходят для изучения долгосрочные последствия корковых лишения, а также последующих явлений поражения пластичности. Сочетание методов стереотаксической с хирургической ампутации ка успешно использовался для изучения воздействия физиологические, поведенческие и молекулярных коркового контроля лишение13,14,15 ,16,,1718,19. Например модель Крыса с двусторонним AC аблаций был использован для изучения последствий корковых уноса в слуховой старт-рефлекс рефлекс и слуховой мозга ответов (ABR)16. Недавно мы сравнили эффекты, что односторонние против двусторонних аблаций крыса переменного тока производят в ABR порогов, амплитуды и задержки в разное время точках после травмы18. Кроме того крысы модель ограничительной уноса переменного тока используется также для изучения влияния corticofugal путь дегенерации в нижней collicus13,14,15 и внутреннего уха17 ,19. После таких манипуляций осуществляется в головном мозге, необходимо оценить локализации, размера и расширение поражений в коре головного мозга. Хотя очень полезным, основное ограничение tonotopic карт на основе нейронных ответов20,21 являются электрофизиологические методы, необходимые для поиска слуховой полей в мозге крыс. Поскольку не все лаборатории имеют необходимое оборудование и/или опыта, чтобы сделать такие записи, мы построили координат карты на основе передачи cytoarchitectural пределов AC изображение поверхности мозга18. Эта карта может быть очень полезным для поиска переменного тока без физиологии тестирование.
Настоящий Протокол описывает метод для вентрикуло гидом местоположение, хирургические экспозиции и абляции переменного тока в крыс. Он также описывает, как использовать наши координаты карта18 легко локализовать расширение поражения над изображением поверхности ablated мозги.
Успешный хирургии зависит от двух факторов: сохранение животного во время и после процедуры и точного местонахождения области интересов. Обеспечение того, что крысы глубоко под наркозом во время операции (проверка вывода рефлекс) и получает адекватного анальгетиков и не ототоксических антибиотиков должно помочь выживания. Кроме того крысы должны храниться на грелку, до тех пор, пока он просыпается от наркоза, чтобы избежать гипотермии. Ушивание уменьшает восприимчивость к инфекции, и правильная техника является жизненно важным: животных будет выбрать на их раны клипы, поэтому они должны быть имплантированы достаточно жесткой для предотвращения удаления без размещения слишком много напряжения на рану.
Чтобы точно найти переменного тока (или любой другой области коры), важно определить позицию bregma, лямбда и интерауральной 0, чтобы использовать их в качестве ссылки для вычисления пределов целевого региона. Любая ошибка при расчете координат приведет к частичной абляции переменного тока или нежелательных стремление других близлежащих районах. Таким образом кончик иглы должны соприкасаться только кости на интерауральной 0, а затем преобразовать координаты Антеро кзади и Медио боковое согласно описанных в настоящем Протоколе.
В этой рукописи мы описали как хирургическим путем предоставления и удалять переменного тока. Существуют три важных шага: процесс бурения, открытие и удаление мозговых оболочек и абляции путем аспирации. Сверление следует выполнять на низкой скорости с минимальным давлением, как высокая скорость бурения генерирует тепла, которое может повлиять на близлежащие подкорковых структур. Однако поддержание низкой скорости и охлаждение области бурения с холодного стерильного физиологического раствора должно предотвратить любые повреждения. Кроме того минимального давления необходимо, чтобы избежать внезапного перерыва черепа и последующие травмы в базовом кору. Открытие и удаление мозговых оболочек, которые охватывают переменного тока должно выполняться тщательно для избежания повреждения кровеносных сосудов. Если кровотечение происходит, ранних и поздних прогноза в целом неблагоприятными и спорно ли такое животное удовлетворяет критериям включения в обзор для надежного исследования. В этом случае мы рекомендуем эвтаназии. Наконец аспирации (вероятно самый трудный аспект в выполнении эффективного поражения), должна быть ограничена серого вещества. Есть два показателя, которые могут помочь обнаружить присутствие белого вещества: (1) изменение цветовой контраст, как белое вещество ярче, чем серого вещества; и (2) прекращение кровотечения из перфорации артерий.
После любой манипуляции в головном мозге, необходимо оценить локализации, размера и расширения процедуры в коре для последующего анализа и проверки достоверности данных, полученных от животных. В этой рукописи мы подробно как локализовать абляции в коре, с помощью координат карты, ранее описанных в нашей группы18. Эта карта была построена с использованием анатомические ссылки, полученные от последовательного раздел реконструкций гистологических срезах, коррелирует с Paxinos и Уотсон Атлас мозга крысы22. Соответственно карта дифференцирует между первичным (A1) и вторичной коре (спинной и брюшной) переменного тока. Основным преимуществом этой координат карты является, что она позволяет быстрой локализации очага поражения путем наложения снято от боковой поверхности мозга, помещены в матрице сагиттальной мозга. Еще одним преимуществом является, что лаборатории с меньшим опытом в анатомии можно использовать карту, адаптируя его к их Животные модели. Это только необходимо задать расстояния между bregma, лямбда и интерауральной 0 ссылок в управления увлажненную мозга и масштаб карты вверх или вниз соответственно. Используйте Rhinal фиссур как ссылка для настройки изображения мозга к карте. Глубина аблации не может определяться в этой координаты карта, поэтому он должен определяться в гистологических срезах головного мозга.
Сочетание стереотаксических методах с хирургического воздействия переменного тока являются базовые методы, которые могут быть легко адаптированы любой следователь, который желает целевой переменного тока в крыса. Это может быть для острого эксперимент, или который требует имплантации постоянного устройства. Кроме того хирургической аблации AC ранее использовались как модель для изучения последствий хронического корковых лишения в слух. AC ампутации может также использоваться для изучения последствий, которые односторонних AC аблаций оказывают в других корковых областях, или служить в качестве модели инсульта. Таким образом экспериментальные проекты, описанные здесь являются полезных методов, которые могут применяться отдельно или в сочетании для широкого круга экспериментальных образцов.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано грант от министерства экономики и конкурентоспособности (МИНЕКО) правительства Испании, SAF2016-78898-C2-2-R.
Stereotaxic frame | David Kopf Ins. | 900 | |
Surgical microscope | WILD M650 Heerbrugg | ||
Heating pad | DAGA | ||
Dental micromotor | W&H elco | 5118 | |
Diamond burr | B Braun | GD021R | 0.6 mm |
Surgical suction device | Atmos | Atmoforte E2 | |
Ketamine | Merial | 30 mg/kg | |
Xylazine | Bayer | 5 mg/kg | |
Micromanipulator | Narishige | SM-11 | |
Scalpel | Lawton | ||
Povidone iodine | Meda | Betadine | |
sterile saline serum | B.Braun | ||
20G sterile needle | Terumo Neolus | ||
Cotton tips | |||
Suture material | B.Braun | ||
Antibiotic Ointment | Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) – Schering-Plough | ||
Forceps | dimeda | 10.331.12 | |
Surgical needles | World Precision Instruments | 501940 | |
Buprenorphine | Indivior UK | Buprex | 0.01-0.05 mg/kg |
Scissor | dimeda | 08.120.15 | |
Spencer scissor | dimeda | 08.804.14 | |
Rongeurs | Lawton | ||
Microsurgical knife | MSP | 7503 | |
Absorbable hemostatic gauze | Surgicel | ||
Saggital rat Brain Matrix | Activational systems Inc. | RBM-1000DV / RBM 4000C | |
Sodium pentobarbital | Vetoquinol | 0.1 mL | |
Camera | Olympus 5.1 MP | C-5060 wide zoom | lens F2.8-4.8 |
Wound clips | Reflex 9 | 9 mm | |
Canvas 12 | ACD Systems | ||
needle gauge | diameter 1.8 mm | ||
Separatory funnel | labbox | 11409 | 500 mL |
GluA2 primer Forward | GeneBank | NM_017261 | CGGCAGCTCAGCTAAAAACT |
GluA2 primer Reverse | GeneBank | NM_017261 | TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA |
GluA3 primer Forward | GeneBank | NM_032990 | ATTGCTGATGGTGCAATGAC |
GluA3 primer Reverse | GeneBank | NM_032990 | TTTGCATTGTCGCAAGTCTC |