我们描述了一种方法的 stereotactically 引导的位置, 暴露, 并消融大鼠的听觉皮层。使用坐标图对消融的定位进行评估。
大鼠听觉皮层 (AC) 在听觉神经学研究者中越来越受欢迎, 他们对经验依赖性可塑性、听觉知觉过程以及皮层下听觉核声音处理的控制有兴趣。为了应对新的挑战, 准确定位和手术暴露听觉皮层的程序将加速这项研究工作。立体定向神经外科通常用于动物模型的临床前研究, 以嫁接在听觉皮层的一个预定位置的针或电极。在下面的协议中, 我们采用了一种新颖的立体定向方法。我们在老鼠的颞骨表面确定了四坐标点, 以定义一个窗口, 一旦打开, 就能准确地暴露 AC 的主 (A1) 和次 (背和腹) 皮质. 使用这种方法, 我们然后进行手术消融的 AC。在进行这种操作后, 有必要评估皮质内病变的定位、大小和外延。因此, 我们也描述了一种方法, 以方便地定位的交流烧蚀使用的坐标图构造通过转移细胞限制的 ac 到大脑的表面。在坐标图中, stereotactically 引导位置和消融的交流与损伤区域的定位相结合, 有助于验证从动物获得的信息, 并导致更好的分析和对数据的理解。
大鼠是听觉神经科学中最常用的动物模型之一。其行为的稳健性使其能够每天进行数百次试验。它的敏感性和光谱敏锐为听力1,2, 并且它的中央系统的解剖和功能组织, 可比较其他哺乳动物3, 使老鼠一个适当的动物模型分析各种各样的听觉神经科学的研究课题。大鼠的听觉皮质 (AC), 特别是, 一直是一些解剖和生理学研究的主题, 试图了解它的结构, 组织, 并在声音处理3的作用。现在, AC 已成为流行的神经学家感兴趣的经验依赖可塑性, 听觉知觉, 突触基础的接受外地组织, 和皮质控制的声音处理在皮层下听觉核4,5,6,7,8,9。为了应对这些新方法所带来的挑战, 能够准确定位和手术暴露交流的程序将加速研究工作。立体定向技术使大脑中的特定区域在没有生理学测试的情况下很容易本地化。虽然动物之间的大脑大小稍有不同, 但任何脑区的位置都可以用大鼠脑部颅骨上地标的立体坐标来确定。
限制消融的 AC 是手术切除的感觉区的皮层最直接相关的听觉。与其他用于阻断 ac 活动的方法相比, 如冷却或局部利多卡因注射液10,11,12, 手术切除 ac 会导致慢性功能丧失。因此, 交流消融更适合研究皮质剥夺的长期影响, 以及随后的损伤可塑性现象。立体定向方法与手术消融的结合已成功地用于研究皮质控制剥夺的生理、行为和分子效应13,14,15 ,16,17,18,19。例如, 用双侧交流消融的大鼠模型研究了皮层消融对听觉惊吓反射和听觉脑干反应 (ABR)16的影响。最近, 我们比较了单侧与双侧消融对大鼠 AC 产生的影响在 ABR 阈值, 振幅, 和潜伏期在不同时间点后的伤害18。此外 , 还利用大鼠限制流消融模型研究了 corticofugal 通路变性在下位 collicus 中的作用 :13、14、15和内耳17 ,19。在大脑中进行这种操作后, 有必要评估皮质内病变的定位、大小和外延。虽然非常有用, 但基于神经元响应的 tonotopic 映射的主要限制20,21是在大鼠大脑中定位听觉场所需的电生理学技术。由于并非所有的实验室都有必要的设备和/或专门知识来进行此类录音, 因此我们构建了一个坐标图, 该地图基于交流电的细胞极限与大脑表面的图像18的转移。这张地图是非常有用的定位 AC 没有生理学测试。
本协议描述了一种方法的 stereotactically 引导定位, 手术暴露和消融的交流在大鼠。它还描述了如何使用我们的坐标图18来轻松地将病灶的延伸定位在被消融的大脑表面的图片上。
成功的脑部手术取决于两个因素: 在手术过程中和术后保持动物存活, 并准确定位感兴趣的区域。确保大鼠在手术过程中进行深度麻醉 (测试戒断反射), 并接受足够的止痛药和 non-ototoxic 抗生素有助于生存。另外, 老鼠应该被放在加热垫上, 直到它从麻醉中苏醒, 以避免体温过低。缝合将减少感染的易感性, 适当的技术是至关重要的: 动物会选择在他们的伤口夹, 所以他们应该被植入足够紧, 以防止移除, 而不会在伤口上施加太多的张力。
要准确定位 AC (或任何其他皮质区域), 重要的是要确定 bregma、lambda 和耳0的位置, 以使用它们作为计算目标区域的极限的参考。在计算坐标时的任何错误都会导致部分消融或其他周围地区的不受欢迎的吸入。因此, 针尖应只接触骨在耳 0, 然后翻译前后和译侧坐标根据本议定书所描述的。
在这篇手稿中, 我们也描述了如何手术暴露和蚀交流。有三关键步骤: 钻探过程中, 脑膜的打开和切除, 以及经穿刺消融。钻孔应以最低的速度以最小的压力进行, 因为高的钻孔速度产生的热量会影响附近的皮层结构。然而, 保持低速和冷却的钻孔区域与冷的无菌盐水应防止任何损害。此外, 最小的压力是必不可少的, 以避免突然断裂的头骨和随后的伤害的基础皮层。打开和切除覆盖 AC 的脑膜应小心, 以避免血管破裂。如果出血发生, 早期和晚期的预后通常是不赞同的, 这是值得怀疑的, 这种动物是否符合纳入标准的可靠研究。我们建议在这种情况下安乐死。最后, 吸入 (可能是最困难的方面, 在执行一个有效的损害), 必须限制在灰色物质。有两个指标可以帮助检测到白质的存在: (1) 颜色对比的变化, 因为白质比灰色的物质亮;(2) 从穿孔动脉停止出血。
在大脑中进行任何操作后, 必须评估在皮层中所做的程序的定位、大小和扩展, 以便随后对从该动物获得的数据进行分析和验证。在这篇手稿中, 我们详细介绍了如何使用我们组18之前描述的坐标图定位在皮层中进行的消融。这张地图是利用从组织学切片的连续部分重建获得的解剖参考, 与大鼠脑的 Paxinos 和沃森图谱22相关。因此, 该地图区分的主要 (A1) 和第二皮质 (背部和腹) 的 AC。这一坐标图的主要优点是, 它可以通过叠加一张从大脑外侧表面被放置在矢状脑基质中的图片来快速定位病灶。另一个优点是, 在解剖学方面经验较少的实验室可以通过将它改编成动物模型来使用这张地图。只需要设置 bregma, λ, 和耳0参考在一个控制灌流大脑的距离, 并相应地缩放地图。使用鼻腔裂隙作为参考, 调整大脑的图片到地图。此坐标图不能确定消融深度, 因此应在脑组织学切片中确定。
立体定向的方法与手术接触的交流是基本的方法, 可以很容易地适应任何研究者谁希望针对 ac 在鼠年。这可能是一个急性实验或一个需要植入永久设备。此外, 手术消融的 AC 已过去作为一个模型, 研究慢性皮质剥夺的影响, 听力。ac 消融也可用于研究单侧 ac 消融在其他皮层区施加的影响, 或作为中风模型。因此, 本文所描述的实验设计是一种有用的方法, 可以单独或组合应用于广泛的实验设计。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了西班牙政府经济和竞争力部 (MINECO) 的资助, SAF2016-78898-C2-2-R。
Stereotaxic frame | David Kopf Ins. | 900 | |
Surgical microscope | WILD M650 Heerbrugg | ||
Heating pad | DAGA | ||
Dental micromotor | W&H elco | 5118 | |
Diamond burr | B Braun | GD021R | 0.6 mm |
Surgical suction device | Atmos | Atmoforte E2 | |
Ketamine | Merial | 30 mg/kg | |
Xylazine | Bayer | 5 mg/kg | |
Micromanipulator | Narishige | SM-11 | |
Scalpel | Lawton | ||
Povidone iodine | Meda | Betadine | |
sterile saline serum | B.Braun | ||
20G sterile needle | Terumo Neolus | ||
Cotton tips | |||
Suture material | B.Braun | ||
Antibiotic Ointment | Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) – Schering-Plough | ||
Forceps | dimeda | 10.331.12 | |
Surgical needles | World Precision Instruments | 501940 | |
Buprenorphine | Indivior UK | Buprex | 0.01-0.05 mg/kg |
Scissor | dimeda | 08.120.15 | |
Spencer scissor | dimeda | 08.804.14 | |
Rongeurs | Lawton | ||
Microsurgical knife | MSP | 7503 | |
Absorbable hemostatic gauze | Surgicel | ||
Saggital rat Brain Matrix | Activational systems Inc. | RBM-1000DV / RBM 4000C | |
Sodium pentobarbital | Vetoquinol | 0.1 mL | |
Camera | Olympus 5.1 MP | C-5060 wide zoom | lens F2.8-4.8 |
Wound clips | Reflex 9 | 9 mm | |
Canvas 12 | ACD Systems | ||
needle gauge | diameter 1.8 mm | ||
Separatory funnel | labbox | 11409 | 500 mL |
GluA2 primer Forward | GeneBank | NM_017261 | CGGCAGCTCAGCTAAAAACT |
GluA2 primer Reverse | GeneBank | NM_017261 | TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA |
GluA3 primer Forward | GeneBank | NM_032990 | ATTGCTGATGGTGCAATGAC |
GluA3 primer Reverse | GeneBank | NM_032990 | TTTGCATTGTCGCAAGTCTC |