島の試金は比較的新しい、コスト効果の高いアッセイキイロショウジョウバエの基本的な運動動作を評価するために使用できます。本稿では、自動データ処理と島のアッセイのデータ、このアッセイの大きな遺伝的または薬理学的画面の高感度、高速読み出しの客観的定量化のためのアルゴリズムについて説明します。
次世代シーケンシング技術の進歩は、運動障害の増加速度で他の神経学的な病気 (候補者) 疾患遺伝子の同定に貢献します。しかし、少しはこれらの疾患の根底にある分子メカニズムについて知られています。キイロショウジョウバエの遺伝、分子のおよび行動のツールボックスは、このモデル生物を高スループット方法で新しい病気の遺伝子のメカニズムを特徴付けるに特に便利になります。それにもかかわらず、高スループットの画面を理想的には、これらの疾患に関連する形質の自動化の定量化を可能にする、コスト効率の高い効率的かつ信頼性の高いアッセイが必要です。島の試金は費用対効果と簡単にセットアップ方法ショウジョウバエの歩行動作を評価します。このアッセイでハエはプラットフォーム上に固定の高さからスローされます。これは、プラットフォームから秒以内に脱出する飛ぶことができる生得的な運動反応を誘導します。現在、撮影島アッセイの定量分析は、手動で行うが、大画面を実行する場合は特に骨の折れる作業であります。
この原稿では、高スループット、自動データ処理島アッセイ データの定量化に「ショウジョウバエ島アッセイ」と「島の試金分析」のアルゴリズムについて説明します。セットアップでノート パソコンに接続されているシンプルなウェブカメラは試金の実行はプラットフォームのイメージのシリーズを収集します。フィジーのオープン ソース ソフトウェアの開発「ショウジョウバエ島アッセイ」アルゴリズムは、これらイメージ シリーズを処理し、、実験条件ごと時間の経過と共にプラットフォーム ハエ数を定量化。自動的に得られたデータを処理し、治療および遺伝子型が統計的に有意に異なるかどうかを計算します、「島の試金分析」スクリプト、フリー ソフトウェア R と互換性が開発されました。これは大幅島アッセイの効率を向上させ、基本的な歩行や飛行行動の強力な読み出しになります。それはこうして調査飛ぶ運動能力運動障害と薬効のショウジョウバエモデルの大型スクリーンに適用できます。
脳 (例えば、小脳性運動失調とパーキンソン病)、末梢神経の変性疾患が根底にある遺伝子の同定に、近年、次世代シーケンシング技術の進歩が大きく貢献してください。(例えば、筋萎縮性側索硬化症、遺伝性痙性対麻痺) の起源と筋の起源 (例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー)1,2,3,4.それにもかかわらず、これらの疾患のほとんどの根底にある分子メカニズムについてはほとんど知られています。治療法の開発には、これらのメカニズムの理解が欠かせません。
人間のようにフライトやショウジョウバエ、歩行などのモデル生物の動きは、中央脳、末梢神経系と筋肉によって制御されます。さらに、高速生成時間とショウジョウバエの遺伝のツールボックスを作るこのモデル生物遺伝子の高スループット スクリーニングに適して関与運動障害、薬物検査の5,6.このような画面は、信頼性が高く、コスト効率の高いと相対的なシンプルなアッセイとして自動化された方法で出力結果を定量化するためのツールでテストする必要がある条件のかなりの数のため、非常に望ましい。
シュミットら(2012 年)7 「島の試金」と呼ばれる低コスト テストを説明したショウジョウバエの歩行動作を評価します。島アッセイがグリア細胞に固有の機能と7、ショウジョウバエモデル知的障害8との一般的な評価のための評価の遺伝子を識別するために正常に大規模な上映で使用されてモーター動作9を飛ぶ。島の試金の原則の設計は、いくつかのハエのスローを高架のプラットフォームで構成されます。これは健全なハエのプラットフォームから秒以内に脱出することができる生得的な運動行動を誘導します。アッセイは、時間7,8,9以上のプラットフォームで残りのハエの数を測定します。これらすべての機能は、島アッセイが運動障害に関与する遺伝子の強力なスクリーニング ツールであることを示します。
現在、撮影島アッセイ データの量的分析は7、8,9を手動で行われます。アッセイの効率を向上させる、半自動的にプラットフォームからハエのエスケープを定量化する低コストの方法を開発しました。セットアップ上のプラットフォームでのハエの数を定量化する一連のフレームを持つ、プラットフォームの取得ごとに 0.1 s. フレームは「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロで処理して画像時間を収集するためにノート パソコンに接続されているシンプルなウェブカメラを使用してください。時間。「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロは 3 つの独立したサブ マクロに分かれています: (I)「作成スタックと投影」サブのマクロは別々 のサブフォルダーに格納されている別の島実験を識別し、スタックとそれぞれの投影を作成しますタイム シリーズ。(II)「定義プラットフォーム」サブ マクロが連続して利益 (率 ROI) の領域として島式ホームを手動で定義するその時点でユーザーが要求される個々 実験サブフォルダーにあるすべての”Projection_image_name.tif”ファイルを開きます。(III)「分析」は、自動的にプラットフォームで残りの時間シリーズ間ハエ数を定量化します。連続 (実行) でサブのマクロを実行できるまたは独立。統計的データ解析のための治療および遺伝子型動作お互い (図 1) と大幅に異なるかどうかを決定する統計テストを適用して自動的に得られたデータを処理するスクリプトが開発されました。最後に、(AT) 失調症毛細血管拡張症ショウジョウバエモデルの異常な運動能力を定量化して評価このセットアップが使えることを示した。
このプロトコルでは、島のアッセイ中ショウジョウバエモーター動作を定量的に評価「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロについて説明します。マクロは、正確に高感度・運動の欠陥の定量的高スループット評価に適した島アッセイを行う時間をかけてのプラットフォームでハエをカウントします。方法論により、任意の条件の比較のためハエ薬曝露を含む、異なる遺伝的または環境条件下で栽培できます。この読み出しは運動障害のショウジョウバエモデルと他の神経疾患を勉強して大きな遺伝的または医薬品の画面を実行するとき、または歩行またはフライトを調べる検出ツールとして特に有用、します。動作です。
この原稿で示される島の試金プロトコルは、既存/代替方法上の利点を提供します。たとえば、ビデオ追跡歩行ははるかに時間がかかり、大規模なサンプル サイズのテストには適して。島の試金は高スループット スクリーニング ツールをあり、この意味で、迅速な対話型負走 (リング) アッセイ16に匹敵します。2 つの違いは、広範な運動の問題を検出するため島の試金ができます。降壇するハエの無力は、ジャンプ、飛行中の欠陥によって生じるまたはによる歩行行動特性 (筋肉・神経) の翼や脚 (筋肉・神経) の欠陥。その一方で、リング アッセイは登山歩行動作脚 (筋肉・神経) 欠陥によって引き起こされる欠陥を評価します。に備えてユーザー複数行動読み出しに興味を持っている、島アッセイはリング法などの他のアッセイでも簡単に結合できます。さらに、光遺伝学に必要なレーザーは島のアッセイでは、簡単にインストールできるし、セットアップがとても簡単なそれすることができます簡単に温度と光を制御できる部屋に移動すること。
成功とここで説明島アッセイの再現性を確保するため、いくつかの推奨事項に従ってください。因数と転送実験にハエは CO2か風邪麻酔の影響を避けるために実験の前に少なくとも 1 日でバイアルします。実験バイアルを満杯になるか (バイアルあたり 10-15 ハエを使用; バイアルあたりハエの数が同じを常に配置するが最適です)。生鮮食品にハエを保つため、すべての回で。そうでない場合はまだアッセイを行うに精通して、収率を最大限にプラットフォームに飛ぶ練習を投げます。また手をすぐに取り消し、練習データの解析 (画像解析と画像の手が後にのみ開始をカウントのフライ) と干渉する、その後、右します。環境・実験の条件を比較する必要がある実験で同一に保つ (異なった年齢でテスト対変異または遺伝子型のコントロールなど)。常に同じ時刻で実験を実行し、制御温度と湿度の条件の下でバイアルを維持します。統計的検出力の生物あたり、少なくとも 3 つの技術的なレプリケートをテストします。
説明するマクロのパフォーマンスの成功を確保するためここでは、ウェブカメラとイメージの設定する必要があります調整する最大コントラストを達成するために: 飛ぶ白いプラットフォーム上の黒のオブジェクトとして表示されます。マクロでハエの数を適切にカウントされないときのコントラストの設定を調整、投資収益率が選択が適切かどうかを確認、プラットフォームにおけるハエのサイズが指定した最小値以上であることを確認サイズの設定 (このプロトコルの手順 8.3 参照) を飛ぶ。設定は一度定義するだけです。彼らは、ウェブカメラとプラットフォーム間の距離が変更されない限り、すべての実験に適用されます。Circularity_min と最大の設定を定義、粒子の真円度 (粒子カウント ハエを =) 分析のために考慮するが表示されます (飛ぶカウントが設定されたオブジェクトを =)。1 は完全な円を表し、0 行17。ハエは、循環 (ハエは直線として表示できません) のある程度を常に存在、ので”Circularity_max”設定が 1 で、”Circularity_min”設定が 0.4 で。それはユーザーがこれらの設定を調整する必要があることはできません。
マクロ時折ミス カウント時にハエがプラットフォームの国境近くに位置しています。これは、ユーザー定義の投資収益率のうち徒歩がハエが飛ぶことができない場合に発生します。ほとんどの場合、投資収益率 (プラットフォームに可能な限りそれをフィッティング) を再度選択することによってこの問題が解決する簡単にできます。しかし、「島の試金分析」スクリプトを検出することが、投資収益率を比較的よくウォーキング ハエによる正しい不適切なデータ数。ここで紹介するウェブカメラの解像度が十分に高い近接かなりよくハエを差別するが実施して追加アルゴリズム「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロの画像処理手順のよう、流域関数17をむしばむと。これらはプラットフォームに近接しているハエの適切な描写を促進します。加えて、マクロはプラットフォームから飛び降りまたはそれから離れて飛んでいるハエを区別することができます。それにもかかわらず、健康な若い飛ぶ系統も飛んで古いや歩行の赤字蠅プラットフォームに長く残ると最終的に跳ぶか、またはプラットフォームから落ちるに対し、プラットフォームにドロップしたら直ちにが一般的に観察されます。これらの制限にもかかわらずアッセイと分析は、行動の非常に正確な測定を提供します。
「島の試金分析」スクリプトのパフォーマンスの成功を確保するため、ユーザーがプロトコルで指定されるスクリプト行で入力と出力ファイルの正しいパスを入力すると (示されるように適切なフォルダー形式でデータを提供するかどうかを確認するには図 2)。ユーザーにあまりにも厳しい信頼性の低い実験データをフィルター処理するための条件が検出された場合 (行 68:「数」の列の最初の値が 5 未満; 71 行:「数」の列の最初の値は、プラットフォーム上でスローされたハエの数の合計より高いrm +3) オフ行 68 と 71「島の試金分析」スクリプトでテキスト前に # 追加することによってこれらフィルターの設定。この場合、すべてのデータセットは、分析されます。また、フィルターの設定は、行 68 とユーザーのニーズによると 71 の値を調整することによって変更できます。「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロによって生成された”results.txt」のカウント値の可能な成果物も手動で調整することができ、、調整後のデータでスクリプトを再実行することができます。10 fps 以上、または 10 以上の処理中のユーザーの関心とデータの s、「島の試金分析」スクリプトによって処理されるフレーム数が調整します。統計解析は、ユーザー定義の代わりに置き換えることができます。
「例島アッセイは、」島の試金を使用して取得した画像時系列の例を含むをという名前のフォルダーは、次の web サイトで見つけることができます: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1。「例島アッセイ」フォルダーをダウンロードし迅速に徹底、「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロと「島の試金分析」で画像の処理のファイル ストレージの構造このプロトコルで説明されている手順に従ってくださいスクリプトです。
島アッセイ毛細血管拡張性運動失調のショウジョウバエモデルの異常な挙動を定量化して評価で開発したマクロの分析] スクリプトと組み合わせてを使用できます。アッセイは、様々 な年齢層に効率的に適用できます、ので、表現型の潜在的進歩的な性質を分析する適しています。
「ショウジョウバエ島アッセイ」マクロと「島の試金分析」スクリプトと組み合わせて島アッセイは要約すると、客観的に分析し、の自発の欠陥を定量化する費用対効果、信頼性、および効率の高いアッセイショウジョウバエ高スループット方法で運動障害のモデル。
The authors have nothing to disclose.
我々 は、ウィーンショウジョウバエリソースやショウジョウバエ系統を提供するブルーミントンショウジョウバエストック センター (NIH P40OD018537) を認めます。島アッセイ セットアップを構築するため島の試金し、Martijn Eidhof に私たちを導入するための Klämbt 研究所に感謝しております。本研究は E 珍しい 3 共同国境を越えた電話でサポートされている一部の許可「常染色体優性劣性 ataxias 療法の準備」科学的研究 (NWO) のため、オランダの組織からトップの助成金 (912-12-109) によって準備 (NWO 9003037604)2 DCN/Radboud 大学医療センター博士フェローシップ。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。
25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | – |
Logitech C525 HD Webcam | Logitech | – | Any webcam with USB connection is suitable. |
Stand to hold webcam | – | – | – |
Lamp | – | – | 12 V LED lights are appropriate |
Pounding pad | – | – | Any mouse pad works |
Island Assay box | – | – | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20×30 cm. Transparent. |
Island Assay bath | – | – | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
Island/platform | – | – | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
Soap | – | – | Standard dishwashing detergent is suitable. |
Computer | – | – | Scripts run both on Windows and Mac |
Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | – | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
Image-recording software: WebcamCapture | – | – | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
Fiji | – | – | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
R studio | – | – | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
R | – | – | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |