تحليل الجزيرة هو مقايسة جديدة نسبيا، وفعالة من حيث التكلفة التي يمكن استخدامها لتقييم السلوك الحركي الأساسية من melanogaster المورفولوجية. ويصف هذه المخطوطة خوارزميات لمعالجة البيانات الأوتوماتيكية والهدف الكمي للجزيرة تحليل البيانات، مما يجعل هذا الاعتداء قراءات الحساسة، الفائق لشاشات الجينية أو صيدلانية كبيرة.
التطورات في تقنيات الجيل التالي تسلسل تسهم في تحديد جينات المرض (مرشح) لاضطرابات الحركة وغيرها من الأمراض العصبية بسرعة متزايدة. ومع ذلك، يعرف الكثير عن الآليات الجزيئية التي تكمن وراء هذه الاضطرابات. الأدوات الجينية والجزيئية، والسلوكية ل melanogaster المورفولوجية يجعل هذا الكائن نموذج مفيدة بشكل خاص لوصف الجينات الأمراض الجديدة والآليات بطريقة الفائق. ومع ذلك، تتطلب شاشات الفائق فحوصات فعالة وموثوق بها أنه، من الناحية المثالية، فعالة من حيث التكلفة، والسماح للتحديد الكمي الخاص للصفات ذات الصلة لهذه الاضطرابات. والرزن الجزيرة هو فعالية من حيث التكلفة وسهولة إنشاء أسلوب لتقييم السلوك الحركي المورفولوجية . في هذا الفحص، يتم طرح الذباب على منصة من ارتفاع ثابت. وهذا يدفع استجابة الحركية فطرية التي تمكن من الذباب للهروب من النظام الأساسي في غضون ثوان. في الوقت الحاضر، تتم التحاليل الكمية للجزيرة صورت الاختبارات يدوياً، وهي مهمة شاقة، ولا سيما عند أداء شاشات كبيرة.
ويصف هذه المخطوطة الخوارزميات “المورفولوجية الجزيرة المقايسة” و “تحليل الإنزيم الجزيرة” الفائق والتجهيز الآلي للبيانات والقياس الكمي للبيانات المقايسة الجزيرة. في الإعداد، يجمع كاميرا ويب بسيطة متصلة بجهاز كمبيوتر محمول لسلسلة صورة من المنصة بينما تتم التحليل. الخوارزمية “المورفولوجية الجزيرة المقايسة” المتقدمة لبرمجيات المصدر المفتوح فيجي عمليات سلسلة هذه الصورة ويوضحها، لكل حالة تجريبية، عدد الذباب على منصة على مر الزمن. البرنامج النصي “تحليل الإنزيم الجزيرة”، متوافقة مع البرمجيات الحرة R، ووضعت لمعالجة البيانات التي تم الحصول عليها تلقائياً وحساب ما إذا كان العلاج/الأنماط الجينية تختلف إحصائيا. هذا إلى حد كبير يحسن كفاءة الإنزيم الجزيرة ويجعل من قراءات قوية للحركة الأساسية والسلوك الرحلة. وبالتالي فإنه يمكن تطبيقها على شاشات كبيرة تحقق القدرة الحركية يطير، نماذج المورفولوجية لاضطرابات الحركة، وفعالية العقاقير.
وفي السنوات الأخيرة، أوجه التقدم في تقنيات الجيل التالي التسلسل قد أسهمت إسهاما كبيرا تحديد الجينات الكامنة وراء الاضطرابات التنكسية حركة الدماغ (مثلاً، ترنح الدماغ والرعاش)، من الخلايا العصبية الطرفية الأصل (مثل التصلب العضلي الجانبي والشلل النصفي التشنجي وراثية)، ومن أصل العضلات (Duchenneمثل ضمور العضلات وضمور myotonic)1،2،3،4 . وعلى الرغم من هذا، يعرف الكثير عن الآليات الجزيئية التي تكمن وراء معظم هذه الاضطرابات. فهم أفضل لهذه الآليات أساسي لتطوير العلاجات.
كما هو الحال في البشر، وهو حركة في نموذج الكائنات، مثل الطيران والحركة في المورفولوجية، يسيطر عليها وسط المخ والجهاز العصبي المحيطي، والعضلات. وباﻹضافة إلى ذلك، الوقت جيل سريع والأدوات الجينية المورفولوجية لجعل هذا الكائن نموذج ملائمة بصفة خاصة للفرز الفائق للجينات المشاركة في اضطرابات الحركة وللمخدرات اختبار5،6 . بسبب عدد كبير من الظروف التي تحتاج إلى اختبار في هذه الشاشات، موثوقة وفعالة من حيث التكلفة، وفحوصات بسيطة نسبيا، فضلا عن أدوات لقياس نتائج المخرجات بطريقة تلقائية، مرغوب فيه للغاية.
شميت وآخرون (2012) 7 وصف اختبار منخفضة التكلفة يسمى “المقايسة الجزيرة” لتقييم السلوك الحركي المورفولوجية . والرزن الجزيرة قد استخدمت بنجاح في عروض واسعة النطاق لتحديد الجينات مع المهام الخاصة بإطلاق7، في تقييم نماذج المورفولوجية للإعاقة الفكرية8، والتقييم العام يطير السلوك الحركي9. تصميم مبدأ المقايسة الجزيرة يتكون من منصة مرتفعة على الذي يتم طرح عدد الذباب. وهذا الحث على سلوك الحركية فطرية التي تمكن الذباب صحية للهروب من النظام الأساسي في غضون ثوان. تدابير المقايسة عدد الذباب المتبقية على المنصة على مر الوقت7،،من89. كل هذه الميزات تشير إلى أن الإنزيم الجزيرة قد تكون أداة فحص قوية للجينات المشاركة في اضطرابات الحركة.
حاليا، أن التحليل الكمي للجزيرة صورت تحليل البيانات يتم ذلك يدوياً7،،من89. لتحسين كفاءة التحليل، تم تطوير طريقة منخفضة التكلفة لشبه تلقائياً التحديد الكمي لهروب الذباب من المنصة. الإعداد يستخدم كاميرا ويب بسيطة متصلة بجهاز كمبيوتر محمول لجمع الوقت صورة سلسلة من منهاج العمل، مع إطارات المكتسبة 0.1 كل الإطارات س. ثم تجهز مع الماكرو “المورفولوجية الجزيرة المقايسة” التي يوضحها عدد الذباب على المنصة على مدى الوقت. الماكرو “المورفولوجية الجزيرة المقايسة” ينقسم إلى ثلاث وحدات الماكرو الفرعية المستقلة: (ط) “إنشاء مكدس والإسقاط،” الماكرو الفرعية تحدد تجارب جزيرة مختلفة مخزنة في مجلدات فرعية مختلفة وإنشاء كومة واسقاطا لكل السلسلة الزمنية. (ثانيا) التتالي سيفتح الماكرو الفرعية “منصة تعريف” كافة الملفات “Projection_image_name.tif” الموجودة في المجلدات الفرعية التجريبية الفردية، عند هذه النقطة هو طلب المستخدم يدوياً تحديد منصة الجزيرة كالمنطقة للفائدة (العائد على الاستثمار). (ثالثا) “تحليل” يقد تلقائياً عدد الذباب المتبقية على المنصة خلال السلسلة الزمنية. يمكن تشغيل وحدات الماكرو الفرعية التتالي (في شوط واحد) أو بشكل مستقل. لتحليل البيانات الإحصائية، ووضعت برنامج نصي لمعالجة البيانات التي تم الحصول عليها تلقائياً وتطبيق اختبار إحصائية لتحديد ما إذا كان العلاج/الأنماط الجينية تتصرف تختلف اختلافاً كبيرا عن بعضها البعض (الشكل 1). وأخيراً، ثبت أن هذا الإعداد يمكن استخدامها لتقييم وقياس القدرة الحركية الشاذة نموذج المورفولوجية لترنح-توسع الشعيرات (في).
ويصف هذا البروتوكول الماكرو “المورفولوجية الجزيرة المقايسة” الذي يقيم كمياً المورفولوجية السلوك الحركي أثناء الفحص الجزيرة. دقة حساب الماكرو الذباب على المنصة على مر الزمن، مما يجعل المقايسة الجزيرة حساسة للغاية ومناسبة للتقييم الكمي الفائق لعيوب الحركي. تسمح المنهجية لمقارنة أي شرط، مع الذباب نمت تحت ظروف مختلفة الوراثية و/أو البيئية، بما في ذلك التعرض للمخدرات. قراءات هذا مفيدة بشكل خاص كأداة اكتشاف وهكذا عند أداء شاشات الجينية أو صيدلانية كبيرة، عند دراسة نماذج المورفولوجية لاضطرابات الحركة وغيرها من الأمراض العصبية، أو عند دراسة الحركة أو الطيران السلوك.
وينص البروتوكول المقايسة الجزيرة المعروضة في هذه المخطوطة مزايا أكثر الأساليب القائمة البديلة. على سبيل المثال، الحركة تتبع الفيديو وقتاً أكثر بكثير وأقل ملاءمة لاختبار العينات ذات الأحجام الكبيرة. تحليل الجزيرة هو أداة فرز الفائق، وفي هذا المعني، فهي مماثلة ل الفحص السريع جيوتاكسيس السلبية التفاعلية (RING)16. الفرق بين الاثنين أن فحوصات الجزيرة يسمح للكشف عن مجموعة أوسع نطاقا من المشاكل الحركية؛ عدم قدرة الذباب على مغادرة المنصة يمكن أن يكون سببها عيوب في الرحلة، القفز، أو المشي السلوك الناجم عن الجناح (العضلات/العصبية) و/أو الساق (عضلة/العصبية) العيوب. من ناحية أخرى، يقيم المقايسة خاتم العيوب في التسلق أو المشي السلوك الناجم عن عيوب الساق (عضلة/الخلايا العصبية). في حالة المستخدمين المهتمين في قراءات السلوكية متعددة، يمكن دمج المقايسة الجزيرة أيضا بسهولة مع فحوصات أخرى، مثل التحليل الدائري. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة تثبيت الليزر اللازمة أوبتوجينيتيكس في مربع الفحص الجزيرة، والإعداد بسيطة جداً ويمكن نقلها بسهولة إلى غرفة حيث يمكن التحكم في درجة الحرارة والضوء.
لضمان النجاح وإمكانية تكرار نتائج للمقايسة الجزيرة الموصوفة هنا، ينبغي أن يتبع عدة توصيات. قاسمة ونقل زجاجة الذباب للاختبار التجريبي في أقل من يوم واحد قبل التجربة لتجنب آثار التخدير CO2 أو الباردة. لا أوفيركروود قارورة التجريبية (استخدام 10-15 الذباب كل قنينة؛ فمن الأفضل دائماً وضع نفس عدد الذباب كل قنينة). يبقى الذباب على المواد الغذائية الطازجة في جميع الأوقات. أن لم يكن بعد معتاداً على القيام التحليل، رمي الممارسة الذباب إلى ساحة لتعظيم العائد. الممارسة أيضا تراجعه بسرعة من ناحية اليمين بعد ذلك، كما أنها تتعارض مع تحليل البيانات (تحليل الصور ويطير العد ابدأ إلا بعد اليد خارج الصورة). الحفاظ على الظروف البيئية والتجريبية متطابقة في التجارب التي تحتاج إلى أن تكون المقارنة (مثلاً الضوابط مقابل طفرات أو التركيب وراثي اختبارها في مختلف الإعمار). دائماً إجراء التجارب في نفس الوقت من اليوم، والحفاظ على القنينات في ظل ظروف الرطوبة ودرجات الحرارة التي تسيطر عليها. للسلطة الإحصائية، اختبار replicates التقنية على الأقل ثلاثة كل تكرار البيولوجية.
لضمان نجاح أداء الماكرو هو موضح هنا، يجب تعديل إعدادات كاميرا الويب والصور لتحقيق التباين القصوى: الذباب الظهور كالكائنات السوداء على منصة بيضاء. عندما لا يتم حساب عدد الذباب صحيح الماكرو، قم بضبط إعدادات التباين وتحقق ما إذا تم تحديد العائد على الاستثمار بشكل صحيح، والتأكد من أن حجم الذباب على المنصة أعلى من الحد الأدنى المحدد يطير إعداد حجم (راجع الخطوة 8.3 من هذا البروتوكول). الإعدادات فقط تحتاج إلى تعريف مرة واحدة. فتنطبق على جميع التجارب، طالما لم يتم تغيير المسافة بين الكاميرا ومنهاج العمل. Circularity_min وإعدادات ماكس تعريف تدوير الجسيمات (الجسيمات = الذباب معدود) التي ستؤخذ في الاعتبار للتحليل (الذباب = الكائنات التي تم جردها). 1 يمثل دائرة كاملة، ويمثل 0 سطر17. منذ الذباب يقدم دائماً على درجة معينة من التدوير (ذبابة لا يمكن أن تظهر كخط مستقيم)، يتم تعيين إعداد “Circularity_max” في 1 ويتم تعيين إعداد “Circularity_min” في 0.4. من غير المحتمل أن يحتاج المستخدم لضبط هذه الإعدادات.
الماكرو أحياناً يخطئ العد عندما يطير يقع بالقرب من الحدود لمنهاج العمل. يمكن أن يحدث هذا إذا كان لا يطير الذباب لكن سيرا على الأقدام وخارجها دوروا المعرفة من قبل المستخدم. وفي معظم الحالات، يمكن إعادة تحديد العائد على الاستثمار (تركيب أنه قدر الإمكان إلى المنصة) بسهولة حل هذه المسألة. مع ذلك، البرنامج النصي “تحليل الإنزيم الجزيرة” قادراً على الكشف عن والتهم البيانات غير السليم الصحيح الناجم عن الذباب المشي وخارجها دوروا جيدا نسبيا. على الرغم من أن القرار من كاميرا ويب المعروضة هنا عالية بما فيه الكفاية لتميز الذباب على مقربة من جيد إلى حد ما، قمنا بتنفيذ خوارزميات إضافية في إجراء معالجة الصورة الماكرو “المورفولوجية الجزيرة المقايسة”، مثل مستجمعات المياه وتآكل الدالة17. هذه تسهيل ترسيم السليم من الذباب الموجودة على مقربة من على المنصة. بالإضافة إلى ذلك، الماكرو غير قادر على التمييز بين الذباب الذي قفز من المنصة أو طار بعيداً عن ذلك. ومع ذلك، لوحظ عموما أن سلالات يطير الشباب صحية يطير بعيداً فورا عندما أسقطت على منهاج العمل، بينما كبار الذباب والذباب مع العجز الحركي البقاء لفترة أطول في منهاج العمل وسيتم الانتقال في نهاية المطاف أو تقع قبالة المنصة. وعلى الرغم من هذه القيود، تقديم الفحص والتحليل مقياس دقيق جداً للسلوك الحركي.
لضمان الأداء الناجح للبرنامج النصي “تحليل الإنزيم الجزيرة”، المستخدم لديه للتأكد من إدخال المسارات الصحيحة لملفات الإدخال والإخراج في البرنامج النصي الصفوف المشار إليها في البروتوكول وتقديم البيانات في تنسيق المجلد الصحيح (كما هو موضح في الشكل 2). إذا كان المستخدم يجد المعايير المستخدمة لتصفية البيانات التجريبية يمكن الاعتماد عليها صارمة جداً (صف 68: القيمة الأولى في العمود “حساب” أقل من أو يساوي إلى 5؛ صف 71: القيمة الأولى في العمود “العد” أعلى من إجمالي عدد الذباب ألقيت على بلاتفو rm + 3)، إيقاف هذه إعدادات عامل التصفية عن طريق إضافة # أمام النص في صفوف 68 و 71 في البرنامج النصي “تحليل الإنزيم الجزيرة”. وفي هذه الحالة، ستدرج جميع مجموعات البيانات في التحليل. وبدلاً من ذلك، يمكن تغيير إعدادات عامل التصفية عن طريق تعديل القيم الموجودة في الصفوف 68 و 71 وفقا لاحتياجات المستخدم. ويمكن أيضا تعديل التحف الممكنة في حساب عدد القيم في “results.txt” إنشاؤها بواسطة الماكرو “المورفولوجية الجزيرة المقايسة” يدوياً، ويمكن إعادة تشغيل البرنامج النصي على البيانات المعدلة. عندما يهتم المستخدم بتجهيز أكثر من 10 إطارا في الثانية، أو أكثر من 10 s للبيانات، ينبغي أن عدد الإطارات التي تم معالجتها بواسطة البرنامج النصي “تحليل الإنزيم الجزيرة”تعديل. يمكن أيضا استبدال التحليل الإحصائي ببدائل المعرفة من قبل المستخدم.
يمكن العثور على مجلد يسمى “أمثلة على جزيرة المقايسة،” التي تحتوي على أمثلة مع صورة السلسلة الزمنية التي تم الحصول عليها باستخدام مقايسة الجزيرة، على الموقع التالي: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. تحميل مجلد “أمثلة على جزيرة المقايسة” واتبع الخطوات الموصوفة في هذا البروتوكول يصبح اطلعت بسرعة مع بنية تخزين الملفات، معالجة الصور مع الماكرو “جزيرة المورفولوجية المقايسة”، و “تحليل الإنزيم الجزيرة” البرنامج النصي.
يمكن استخدام التحليل الجزيرة، بالاقتران مع الماكرو المتقدمة والتحليل النصي، لتقييم وقياس السلوك المنحرف حركة نموذج المورفولوجية لتوسع الشعريات ترنح. حيث يمكن تطبيق الفحص كفاءة لمختلف الإعمار، أنها مناسبة تماما لتحليل طبيعة تقدمية يحتمل أن تعمل.
وخلاصة القول، مقايسة الجزيرة، بالاقتران مع الماكرو “المورفولوجية الجزيرة المقايسة” والبرنامج النصي “جزيرة المقايسة التحليل”، مقايسة فعالة من حيث التكلفة وموثوق بها وذات كفاءة عالية لتحليل موضوعي وقياس العيوب الحركي من المورفولوجية نماذج اضطرابات الحركة بطريقة الفائق.
The authors have nothing to disclose.
نعترف بمركز الموارد المورفولوجية فيينا ومركز الأسهم بلومينغتون المورفولوجية (P40OD018537 المعاهد الوطنية للصحة) لتوفير سلالات المورفولوجية . ونحن ممتنون للمختبر Klämbt على تقديمه لنا للمقايسة الجزيرة ومارتن ايدهوف لبناء إعداد المقايسة الجزيرة. هذه الدراسة كانت في جزء تدعمها “الدعوة عبر الوطنية المشتركة” ه-نادرة-3 منح “إعداد العلاجات أتاكسياس مقهورة جسمية” تحضير (جمعية البحث العلمي الهولندية 9003037604)، بمنحه أعلى (912-12-109) من “منظمة هولندا” للبحث العلمي (NWO)، وعن طريق زمالتين DCN/رادبود في “الجامعة الطبية مركز الدكتوراه”. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.
25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | – |
Logitech C525 HD Webcam | Logitech | – | Any webcam with USB connection is suitable. |
Stand to hold webcam | – | – | – |
Lamp | – | – | 12 V LED lights are appropriate |
Pounding pad | – | – | Any mouse pad works |
Island Assay box | – | – | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20×30 cm. Transparent. |
Island Assay bath | – | – | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
Island/platform | – | – | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
Soap | – | – | Standard dishwashing detergent is suitable. |
Computer | – | – | Scripts run both on Windows and Mac |
Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | – | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
Image-recording software: WebcamCapture | – | – | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
Fiji | – | – | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
R studio | – | – | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
R | – | – | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |