וזמינותו האי הוא חדש יחסית, חסכונית assay יכול לשמש כדי להעריך את התנהגות גינקולוגיות בסיסי melanogaster דרוזופילה. כתב יד זה מתאר אלגוריתמים עיבוד נתונים אוטומטי, כימות אובייקטיבי של האי assay נתונים, שהופך את assay readout רגיש, תפוקה גבוהה במסכים גדולים גנטית או תרופתי.
ההתקדמות בטכנולוגיות הדור הבא רצפי לתרום זיהוי גנים מחלה (מועמד) הפרעות תנועה, מחלות נוירולוגיות אחרות במהירות גוברת. עם זאת, מעט מאוד ידוע על המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפרעות אלה. ארגז הכלים הגנטי המולקולרי, התנהגותיות של דרוזופילה melanogaster הופך את זה אורגניזם מודל שימושי במיוחד לאפיון גנים מחלה חדשה ומנגנונים באופן תפוקה גבוהה. למרות זאת, תפוקה גבוהה מסכי לדרוש מבחני יעיל ואמין כי, באופן אידיאלי, הם חסכוניים ולא לאפשר כימות automatized של תכונות רלוונטיות להפרעות אלה. האי וזמינותו היא חסכונית בקלות הגדרת שיטה להערכת התנהגות גינקולוגיות דרוזופילה . ב הזה assay, זבובים נזרקים על גבי פלטפורמה של גובה קבוע. זה גורם תגובה מוטורית הטבועה, המאפשרת את הזבובים להימלט מן הרציף בתוך שניות. בזמן הנוכחי, כמותני של האי מצולם מבחני נעשים באופן ידני, וזו משימה מייגעת, במיוחד בעת ביצוע במסכים גדולים.
כתב יד זה מתאר את האלגוריתמים“דרוזופילה האי Assay” ו- “האי Assay ניתוח” תפוקה גבוהה, עיבוד נתונים אוטומטי של כימות של האי assay נתונים. בכיוונון, פשוט מצלמת רשת מחובר למחשב נישא אוסף סדרות תמונה של פלטפורמת בזמן ביצוע וזמינותו. האלגוריתם“דרוזופילה האי Assay” שפותחה עבור תוכנת קוד פתוח פיג’י תהליכים אלה סדרת תמונות, מכמתת, עבור כל תנאי הניסוי, המספר של זבובים על פלטפורמת לאורך זמן. התסריט של “האי Assay ניתוח”, תואם את התוכנה חינם R, פותחה לעיבוד אוטומטי של נתונים המתקבלים, כדי לחשב אם טיפולי/אחרים שונים מבחינה סטטיסטית. זה מאוד משפר את היעילות של האי וזמינותו, מקל על הבדיקה עוצמה ומכניקה בסיסית והתנהגות טיסה. ניתן להחיל אותו ובכך למסכים גדולים חוקרים גינקולוגיות היכולת לעוף, דרוזופילה מודלים של הפרעות תנועה, יעילות התרופה.
בשנים האחרונות, ההתקדמות בטכנולוגיות הדור הבא רצפי תרמו במידה רבה הזיהוי של גנים שבבסיס הפרעות תנועה ניווניות של המוח (למשל, אסטרוציטומה אטקסיה, פרקינסון), של העצבית ההיקפית המקור (למשל, נוירודגנרטיביות, גפיים ספסטית תורשתי), ושל שרירי המקור (למשל, שרירים דושן, ניוון חולים myotonic)1,2,3,4 . למרות זאת, מעט מאוד ידוע על המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס רוב ההפרעות האלה. הבנה טובה יותר של מנגנונים אלה חיוני לפיתוח טיפולים.
כמו אצל בני אדם, תנועה אורגניזמים מודל, כגון טיסה, וחיות ב דרוזופילה, נשלטת על ידי מרכזי המוח, מערכת העצבים ההיקפית, והשרירים. בנוסף, הדור מהיר והזמן גנטי בארגז הכלים של דרוזופילה להפוך את זה אורגניזם מודל מתאים במיוחד עבור ההקרנה תפוקה גבוהה של גנים המעורבים בהפרעות תנועה עבור5,6 בדיקות סמים . עקב מספר משמעותי של תנאי זה צריך להיבדק ב כגון מסכי, אמין, חסכוני, מבחני פשוטה יחסית, וכן כלים לכמת את התוצאות בצורה אוטומטית, הם רצוי מאוד.
שמידט. et al. (2012) 7 תיאר מבחן נמוכים שנקרא “וזמינותו האי” כדי להעריך את התנהגות גינקולוגיות דרוזופילה . וזמינותו האי שימש בהצלחה ב הקרנות בקנה מידה גדול לזיהוי גנים עם פונקציות ייחודיות עכשיו, דונלד7, בהערכה של דרוזופילה מודלים של מוגבלות8, וגם עבור הערכת כללי לטוס התנהגות מוטורית9. העיצוב עיקרון של וזמינותו האי מורכב פלטפורמה מוגבהת שעליו נזרקים כמה זבובים. זה גורם של התנהגות מוטורית מולדת המאפשרת זבובים בריא להימלט מן הרציף בתוך שניות. וזמינותו מודד את מספר זבובים שנותרו על הרציף נגמר הזמן7,8,9. כל התכונות הללו מציינים כי וזמינותו האי עשוי להיות כלי סינון רב עוצמה עבור גנים המעורבים בהפרעות תנועה.
כיום, ניתוח כמותי של האי מצולם assay נתונים מתבצעת באופן ידני7,8,9. כדי לשפר את היעילות של וזמינותו, פותחה שיטה בעלות נמוכה באופן אוטומטי למחצה לכמת הבריחה של זבובים מן הרציף. הגדרת משתמש פשוט מצלמת רשת מחובר למחשב נייד כדי לאסוף את הזמן התמונה סדרה של הפלטפורמה, עם מסגרות רכשה כל 0.1 מסגרות ס’ מעובדים אז עם המאקרו“דרוזופילה האי Assay” מכמת את המספר של זבובים על פלטפורמת מעל הגיע הזמן. המאקרו“דרוזופילה האי Assay” מחולק שלוש פקודות מאקרו עצמאיות משנה: (I) “מחסנית צור, הקרנה,” המשנה מאקרו מזהה אי אחר ניסויים המאוחסנים בתיקיות שונות ויוצר ערימה והקרנה של כל אחד סדרת זמן. (II) המאקרו המשנה “פלטפורמה להגדיר” יפתח ברציפות כל “Projection_image_name.tif” קבצים הממוקמים בתיקיות המשנה בודדים ניסיוני, ובשלב המשתמש הוא מתבקש להגדיר באופן ידני פלטפורמת האי אזור בעל עניין (ROI). (III) “ניתוח” מכמתת באופן אוטומטי את המספר של זבובים שנותרו על הבמה במהלך סדרת הזמן. ניתן להפעיל את פקודות המאקרו משנה ברציפות (בהפעלה אחת) או באופן עצמאי. עבור ניתוח נתונים סטטיסטיים, תסריט פותחה לעיבוד אוטומטי של נתונים המתקבלים, כדי להחיל מבחן סטטיסטי כדי לקבוע אם טיפולי/אחרים מתנהגים שונה באופן משמעותי מזו (איור 1). בסופו של דבר, הוכח כי תוכנית התקנה זו ניתן להשתמש כדי להעריך ולכמת את היכולת גינקולוגיות aberrant של מודל דרוזופילה תסמונת של אטקסיה טלנגיאקטזיה (ב).
פרוטוקול זה מתאר את המאקרו“דרוזופילה האי Assay” הבודק באופן כמותי התנהגות מוטורית דרוזופילה במהלך וזמינותו האי. המאקרו במדויק ספירת הזבובים על פלטפורמת לאורך זמן, ביצוע וזמינותו האי רגיש מאוד ומתאים הערכה כמותית תפוקה גבוהה של פגמים גינקולוגיות. המתודולוגיה מאפשר השוואת תנאי כלשהו, עם זבובים גדל תחת מצבים גנטיים או סביבתיים שונים, כולל חשיפה לסמים. המחוון הזה ולכן שימושי במיוחד ככלי גילוי בעת ביצוע מסכי גנטית או תרופות גדולים, כשלמדתי דרוזופילה מודלים של הפרעות תנועה, מחלות נוירולוגיות אחרות, או כאשר בדיקת גפיים או טיסה התנהגות.
פרוטוקול assay האי שהוצגו בכתב יד זה מספק יתרונות על פני שיטות קיימות/חלופית. לדוגמה, גפיים מעקב וידאו הוא ועתירת פחות מתאים לבדיקה מדגמים גדולים הרבה יותר. וזמינותו האי הוא כלי סינון תפוקה גבוהה, במובן זה, דומה לדקל ה assay מהירה geotaxis שלילי אינטראקטיבי (טבעת)16. ההבדל בין השניים הוא מבחני האי מאפשר איתור של מגוון רחב יותר של בעיות גינקולוגיות; חוסר היכולת של זבובים לעזוב את הפלטפורמה יכולה להיגרם על ידי ליקויים-טיסה, קפיצות, או הליכה להתנהגות הנגרמת על ידי אגף (שריר/עצביים) ו/או הרגל (שריר/עצביים) פגמים. מצד שני, וזמינותו טבעת מעריך פגמים בהתנהגות טיפוס/הליכה הנגרמת על ידי פגמים הרגל (שריר/עצביים). למקרה המשתמשים מעוניינות המפרט התנהגותית מרובים, ניתן לשלב וזמינותו האי בקלות גם עם מבחני אחרים, כגון הטבעת וזמינותו. בנוסף, לייזרים הדרושים עבור optogenetics יכול בקלות להיות מותקן בתיבת האי assay, הסידור הזה כל כך פשוט כי ניתן בקלות להזיז לחדר שבו לטמפרטורה ואור יכול להיות נשלט.
כדי להבטיח את ההצלחה ואת הפארמצבטית של האי וזמינותו המתוארים כאן, צריכה להיות מלווה מספר המלצות. Aliquot והעברת שבקבוקי הזבובים במבחן ניסויי לפחות יום אחד לפני הניסוי כדי למנוע את השפעת ההרדמה CO2 או קור. לא overcrowd את הבקבוקונים ניסיוני (השתמש זבובים 10-15 לכל מבחנה; מומלץ תמיד יש להציב מספר זהה של זבובים לכל מבחנה). שמור את הזבובים על מזון טרי בכל עת. אם לא מוכר כבר עם ביצוע וזמינותו, תרגול זריקת זבובים על הפלטפורמה כדי למקסם את התשואה. גם להתאמן במהירות בכדי לבטל את היד מיד לאחר מכן, כפי זה מפריע ניתוח הנתונים (ניתוח תמונות וטיסה ספירת התחלה רק לאחר היד היא מחוץ לתמונה). לשמור על התנאים הסביבתיים וניסויים זהים בניסויים צריך להשוות (למשל, פקדים נגד מוטציות או של גנוטיפ נבדק בגילאים שונים). תמיד לבצע את הניסויים באותו זמן של היום ולתחזק את הבקבוקונים תחת טמפרטורה מבוקרת, בתנאי לחות. עבור עוצמה סטטיסטית, מבחן משכפל טכנית לפחות שלושה לכל שכפול ביולוגי.
כדי להבטיח את הביצועים מוצלחת של המאקרו המתוארות כאן, מצלמת אינטרנט הגדרות התמונה שתישמר להשגת חדות מירבית: טס להופיע כאובייקטים שחור על משטח לבן. כאשר המספר של זבובים לא נספרת כראוי על-ידי המאקרו, לכוונן את הגדרות החדות, לבדוק אם רועי נבחר כראוי, להבטיח הגודל של הזבובים על הפלטפורמה מעל המינימום שצוין לטוס גודל הגדרת (ראה שלב 8.3 של פרוטוקול זה). ההגדרות רק צריכה להיות מוגדרת פעם אחת. הם חלים על כל הניסויים, כל עוד המרחק בין מצלמת האינטרנט פלטפורמת אינו משתנה. Circularity_min ואת הגדרות מקסימום להגדיר את מעגליות של החלקיקים (חלקיקים = שנספרו זבובים) זה יילקח בחשבון לניתוח (זבובים = שנספרו אובייקטים). 1 מייצג מעגל מושלם ו- 0 מייצג קו17. מאז הזבובים תמיד נוכח מידה מסוימת של מעגליות (זבוב לא יכול להופיע בתור קו ישר), הגדרת “Circularity_max” נקבע על 1, ההגדרה “Circularity_min” מוגדר ב- 0.4. לא סביר כי המשתמש צריך לכוונן הגדרות אלה.
המאקרו מדי פעם עושה טעויות הספירה כאשר זבוב ממוקם בסמוך לגבול של הפלטפורמה. הדבר יכול להתרחש אם הזבובים לא יכולים לעוף אבל הליכה בין רועי על-ידי המשתמש. ברוב המקרים, וטבלה רועי (התאמת זה ככל האפשר פלטפורמת) ניתן בקלות לפתור בעיה זו. אולם, התסריט “האי Assay ניתוח” הוא מסוגל לזהות, הנתונים הנכונים פסולים ספירות הנגרמת על ידי זבובים הליכה ויוצאים רועי בצורה טובה יחסית. למרות הרזולוציה של מצלמת האינטרנט המוצג כאן הוא גבוה מספיק כדי להפלות זבובים בסמיכות יחסית טוב, יישמנו אלגוריתמים נוספים במסגרת ההליך עיבוד התמונה המאקרו“דרוזופילה האי Assay”, כגון קו פרשת המים, לשחוק את הפונקציה17. אלה מאפשרים את התיחום נאותה של הזבובים הנמצאים בסמיכות על הרציף. בנוסף, המאקרו אינו מסוגל להבחין בין זבובים קפץ מן הרציף או עף מחוץ לה. למרות זאת, הוא בדרך כלל ציין כי בריא צעיר זנים לעוף לעוף משם מיד כאשר נפל על הפלטפורמה, ואילו זבובים בוגרים וזבובים עם גירעונות גינקולוגיות להישאר זמן רב יותר על הרציף, בסופו של דבר לקפוץ או ליפול הפלטפורמה. למרות מגבלות אלו, וזמינותו של ניתוח לספק מידה מאוד מדויק של התנהגות גינקולוגיות.
כדי להבטיח את הביצועים מוצלחת של ה-script “האי Assay ניתוח”, למשתמש יש לוודא כדי להזין את הנתיבים הנכון עבור קבצי קלט ופלט השורות התסריט המצוין הפרוטוקול וכדי לספק את הנתונים בתבנית של התיקיה הנכונה (כפי שמצוין איור 2). אם המשתמש ימצא את הקריטריונים המשמשים כדי לסנן נתוני הניסוי לא אמין גם מחמירים (שורה 68: הערך הראשון בעמודה “סמוך” הוא קטן או שווה ל- 5; שורה 71: הערך הראשון בעמודה “ספירה” הוא גבוה יותר מאשר המספר הכולל של זבובים הושלכו על משחקי פלטפורמה. rm +3), בטל את הגדרות סינון אלה על-ידי הוספה של # לפני הטקסט בשורות 68, 71 בקובץ ה-script “האי Assay ניתוח”. במקרה זה, datasets כל ייכללו בניתוח. לחלופין, ניתן לשנות הגדרות המסנן על-ידי התאמת הערכים של שורות 68, 71 על פי צרכי המשתמש. החפצים האפשריים ב ספירת הערכים “results.txt” שנוצר על-ידי המאקרו“דרוזופילה האי Assay” ניתן גם להתאימם באופן ידני, ניתן להפעיל מחדש התסריט על נתונים מנוכי עונתיות. כאשר המשתמש מעוניין עיבוד יותר מ 10 fps, או יותר מ 10 s של נתונים, צריך מספר המסגרות שעובדו על-ידי קובץ ה-script “האי Assay ניתוח”ניתן להתאים. ניתוח סטטיסטי גם יכול להיות מוחלף על ידי חלופות המוגדרות על-ידי המשתמש.
תיקיה בשם “דוגמאות האי Assay,” המכיל דוגמאות עם זמן תמונות-תוך שימוש assay את האי, הסדרה ניתן למצוא באתר הבא: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. הורד את התיקיה “דוגמאות האי Assay” ובצע את השלבים המתוארים פרוטוקול זה כדי במהירות להפוך היכרות עם המבנה של קובץ אחסון, העיבוד של התמונות עם המאקרו “assay דרוזופילה האי”, “האי Assay הניתוח” . התסריט.
האי וזמינותו, בשילוב עם מאקרו מפותחת, ניתוח תסריט, ניתן להשתמש כדי להעריך ולכמת את אופן הפעולה של תנועה חריגה של מודל דרוזופילה של תסמונת אטקסיה טלנגיאקטזיה. מאז וזמינותו ניתן להחיל ביעילות על הגילאים השונים, זה גם מתאים לניתוח אופי פרוגרסיבי פוטנציאל פנוטיפים.
לסיכום, וזמינותו האי, בשילוב עם המאקרו“דרוזופילה האי Assay” התסריט “האי Assay ניתוח”, הוא assay חסכוני, אמין ויעיל מאוד לנתח באופן אובייקטיבי לכמת גינקולוגיות פגמים של דרוזופילה מודלים של הפרעות תנועה באופן תפוקה גבוהה.
The authors have nothing to disclose.
אנו להכיר מרכז המשאבים דרוזופילה וינה ומרכז בלומינגטון דרוזופילה מניות (NIH P40OD018537) למתן זנים דרוזופילה . אנחנו אסירי תודה למעבדה Klämbt פיבי וזמינותו האי, מרטין Eidhof לבניית הגדרת assay האי מחקר זה היה חלק בתמיכת את E-נדיר-3 משותפת חוצה גבולות להתקשר הענק “הכנת טיפולים ataxias הקרים autosomal” הכן (בתחרות 9003037604), על ידי מענק העליון (912-12-109) מארגון הולנד על מחקר מדעי (בתחרות), ועל -ידי שתי מלגות לתואר שלישי מרכז רפואי של DCN/Radboud האוניברסיטה. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.
25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | – |
Logitech C525 HD Webcam | Logitech | – | Any webcam with USB connection is suitable. |
Stand to hold webcam | – | – | – |
Lamp | – | – | 12 V LED lights are appropriate |
Pounding pad | – | – | Any mouse pad works |
Island Assay box | – | – | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20×30 cm. Transparent. |
Island Assay bath | – | – | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
Island/platform | – | – | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
Soap | – | – | Standard dishwashing detergent is suitable. |
Computer | – | – | Scripts run both on Windows and Mac |
Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | – | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
Image-recording software: WebcamCapture | – | – | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
Fiji | – | – | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
R studio | – | – | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
R | – | – | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |