Desenvolvemos um novo protocolo para estudar a dinâmica da população heterocelular em resposta a perturbações. Este manuscrito descreve uma plataforma baseada em imagens que produz conjuntos de dados quantitativos para a caracterização simultânea de múltiplos fenótipos celulares de populações heterocelulares de maneira robusta.
Os processos celulares são complexos e resultam da interação entre vários tipos de células e seu ambiente. As técnicas existentes de biologia celular muitas vezes não permitem uma interpretação precisa dessa interação. Usando uma abordagem quantitativa baseada em imagens, apresentamos um protocolo de alto conteúdo para caracterizar as respostas fenotípicas dinâmicas ( ou seja , mudanças de morfologia, proliferação, apoptose) de populações de células heterogêneas para mudanças nos estímulos ambientais. Destacamos nossa capacidade de distinguir entre tipos de células baseados em intensidade de fluorescência ou características de morfologia inerentes dependendo da aplicação. Esta plataforma permite uma caracterização mais abrangente da resposta da subpopulação a perturbações ao tempo mais curto, quantidades menores de reagentes e menor probabilidade de erro do que os ensaios tradicionais de biologia celular. No entanto, em alguns casos, as populações de células podem ser difíceis de identificar e quantificar com base em células complexasCaracterísticas importantes e exigirá resolução de problemas adicionais; Destacamos algumas dessas circunstâncias no protocolo. Demonstramos esta aplicação usando a resposta ao fármaco em um modelo de câncer; No entanto, pode ser facilmente aplicado de forma mais ampla a outros processos fisiológicos. Este protocolo permite identificar subpopulações dentro de um sistema de co-cultura e caracterizar a resposta particular de cada estímulo externo.
Os ensaios baseados em células foram um campo de trabalho nas pesquisas básicas e nas configurações de desenvolvimento de medicamentos. No entanto, as limitações desses ensaios padrão tornaram-se cada vez mais evidentes com a discordância entre dados clínicos e in vitro e a falha na maioria dos medicamentos para receber aprovação da FDA. Aqui, apresentamos um novo método para a utilização de imagem quantitativa para análise simultânea de fenótipos heterocelulares em resposta a estímulos ambientais relevantes que ocorrem.
Os ensaios tradicionais baseados em células que são utilizados para medir a viabilidade celular incluem: ensaios de exclusão de azul de tripano, MTT / MTS e coloração de citometria de fluxo de anexina V-FITC. Os ensaios de exclusão de Trypan Blue, embora simples e baratos, requerem um grande número de células, são demoradas, e muitas vezes são influenciadas pela polarização do usuário 1 . Os ensaios MTT e MTS medem indiretamente a viabilidade celular através de medidas da taxa metabólica mitocondrial. No entanto, a atividade metabólicaAs células de células podem ser afetadas por diferentes condições de cultura (como a mídia ou a concentração de oxigênio), o que leva a resultados imprecisos e evita a padronização em tipos de células e condições 2 , 3 . Outra grande desvantagem dessas técnicas é a incapacidade de distinguir entre múltiplos tipos de células – a maioria dos sistemas biológicos são heterocelulares. Embora os métodos de citometria de fluxo tenham a capacidade de distinguir entre múltiplas populações de células, os rótulos das células são necessários, a amostragem dinâmica é desafiadora e, ao usar células aderentes, esta aplicação torna-se demorada e propensa a erros.
Outros fenótipos celulares importantes, incluindo mudanças morfológicas, ocorrem em resposta a estímulos ambientais, mas não são capturados por ensaios tradicionais baseados em células. O perfil dos estados celulares através da caracterização morfológica e das semelhanças de mapeamento em amostras é uma ferramenta poderosa e imparcial com aA fim de fornecer novos conhecimentos em muitos aspectos da pesquisa básica e translacional, incluindo biologia celular básica e descoberta de drogas 4 . Além disso, a morfologia das células tumorais mostrou-se correlacionada com subtipos de tumor 5 e agressividade 6 . Por isso, é de grande interesse estudar essas características celulares e como elas se relacionam com perturbações ambientais específicas. Além disso, pode-se usar diferenças nas características morfológicas para discriminar entre subpopulações em sistemas de co-cultura. A rotulação fluorescente de células tem queda ( isto é, alterando as propriedades das células inerentes, demorado) e, portanto, métodos adicionais para classificar os tipos de células são vantajosos.
A imagem baseada em microscopia é um método alternativo para o perfil de fenótipos celulares de forma multiplexada, quantitativa e robusta. Neste manuscrito, aplicamos nosso pipeline de imagens quantitativas para destacar a evoluçãoDinâmica nítida de populações de células heterogêneas dentro de um tumor. Concentramo-nos na interação entre as células do câncer de pulmão não celular pequeno (NSCLC) e os Fibroblastos associados ao câncer (CAFs), o tipo de célula estromal mais prevalente encontrado nos tumores. CAFs foram implicados na iniciação, progressão e resposta terapêutica do tumor; Portanto, realizar ensaios fenotípicos em células tumorais na ausência de CAFs pode ser enganador 7 , 8 , 9 . Especificamente, avaliamos os efeitos de CAFs em células tumorais em resposta a erlotinib, uma molécula pequena visando o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), que é freqüentemente usado no tratamento clínico de NSCLC. Utilizamos uma plataforma de rastreio de alto conteúdo e o software de análise de imagem que o acompanha para avaliação; No entanto, na tentativa de tornar esta metodologia acessível a outros pesquisadores, também desenvolvemos um protocolo downstream comparável usando o software open-source:CellProfiler 10 e CellProfiler Analyst 11 . A maioria dos ensaios de rastreio de alto conteúdo baseados em imagens são analisados com software comercializado específico para um determinado modelo de instrumento. Os resultados são difíceis de replicar em outros laboratórios com diferentes softwares porque os algoritmos subjacentes são muitas vezes proprietários. Utilizando esta tubulação baseada em imagem, foram medidas a proliferação celular, a morte e a morfologia de cada subpopulação de uma cultura heterocelular em resposta ao tratamento medicamentoso utilizando a classificação baseada em fluorescência e morfologia. O protocolo a seguir fornece uma metodologia robusta para testar processos celulares complexos.
The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features.
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately.
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations.
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo National Cancer Institute (NCI) Subvenções U54CA143798 e U54CA143907 para estabelecer Centros de Ciência Física-Oncologia (PS-OCs) no Dana-Farber Cancer Institute e University of Southern California, respectivamente. SM Mumenthaler recebeu um prêmio PS-OC transnetwork que apoiou alguns desses trabalhos.
Gostaríamos de expressar nossa mais profunda gratidão aos nossos apoiantes filantrópicos, particularmente a família Stephenson, Emmet, Toni e Tessa, por sua doação da plataforma Operetta HCS. Também gostaríamos de agradecer a J. Foo para orientação e os membros da equipe do Centro de Medicina Molecular: D. Agus para orientação clínica e orientação, K. Patsch para discussões significativas com projeto experimental, R. Rawat para ajuda em protocolos de análise de imagem , J. Katz para assistência técnica com a Operetta, e P. Macklin e D. Ruderman para discussões e comentários úteis.
RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | cell culture medium |
FBS | Gemini | 100-106 | medium supplement |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | medium supplement |
TC20 | Biorad | 1450102 | cell counter |
TC20 slides with trypan blue | Biorad | 1450003 | cell counter slides |
96-well plates | Corning | 3904 | clear bottom black plates |
Erlotinib | LC Laboratories | E-4007 | |
DMSO | VWR | 317275-100ML | solution to resuspend drug |
Hoechst | Invitrogen | H21491 | nuclear dye |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | dead cell stain |
Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | whole cell stain |
Operetta high content imaging system | Perkin Elmer | ||
CellProfiler | Broad Institue | version 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
Cell culture incubator | Any cell culture incubator will be suitable – cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2. | ||
15 mL Falcon conical tubes | Falcon | 14-959-53A | |
10 cm2 cell culture plates | TPP | 93040 |