Мы разработали новый протокол для изучения динамики гетероклеточной популяции в ответ на возмущения. В этой рукописи описывается платформа, основанная на изображениях, которая создает количественные наборы данных для одновременной характеристики множественных клеточных фенотипов гетероклеточных групп населения.
Сотовые процессы сложны и являются результатом взаимодействия между несколькими типами ячеек и их средой. Существующие методы клеточной биологии часто не позволяют точно интерпретировать это взаимодействие. Используя количественный подход на основе изображений, мы представляем протокол с высоким содержанием для характеристики динамических фенотипических реакций ( т. Е. Изменений морфологии, пролиферации, апоптоза) гетерогенной популяции клеток с изменениями экологических стимулов. Мы подчеркиваем нашу способность различать типы клеток, основанные на интенсивности флуоресценции или присущих морфологии, в зависимости от приложения. Эта платформа позволяет более всестороннюю характеристику субпопуляционного ответа на возмущение при использовании более короткого времени, меньших количеств реагентов и меньшей вероятности ошибки, чем традиционные анализы клеточной биологии. Однако в некоторых случаях клеточные популяции могут быть трудно идентифицировать и количественно, основываясь на комплексной клеткеLar и потребует дополнительного устранения неполадок; Мы выделяем некоторые из этих обстоятельств в протоколе. Мы демонстрируем это применение, используя ответ на препарат в модели рака; Однако его можно легко применить более широко к другим физиологическим процессам. Этот протокол позволяет идентифицировать субпопуляции в рамках системы совместной культуры и характеризовать конкретный ответ каждого на внешние раздражители.
Клеточные анализы были рабочей лошадкой в фундаментальных исследованиях и разработке лекарств. Тем не менее, ограничения этих стандартных анализов становятся все более очевидными с несоответствием между in vitro и клиническими данными и неспособностью большинства лекарств получать одобрение FDA. Здесь мы представляем новый метод использования количественной визуализации для одновременного анализа гетероклеточных фенотипов в ответ на соответствующие совместно происходящие экологические стимулы.
Традиционные клеточные анализы, которые используются для оценки жизнеспособности клеток, включают в себя: анализы исключения трипанового синего, MTT / MTS и окрашивание проточной цитометрии приложением V-FITC. Тесты исключения Trypan blue, простые и недорогие, требуют большого количества ячеек, занимают много времени и часто зависят от смещения пользователя 1 . Анализы MTT и MTS косвенно измеряют жизнеспособность клеток посредством измерения скорости метаболизма митохондрий. Однако метаболическая активностьНа клетки могут влиять различные условия культивирования (такие как концентрация меди или кислорода), что приводит к неточным результатам и предотвращает стандартизацию по типам и условиям клеток 2 , 3 . Другим серьезным недостатком этих методов является их неспособность различать несколько типов клеток – большинство биологических систем являются гетероклеточными. В то время как методы проточной цитометрии обладают способностью различать несколько популяций клеток, требуются клеточные метки, динамическая выборка является сложной задачей, и при использовании присоединяемых ячеек это приложение становится трудоемким и подверженным ошибкам.
Другие важные фенотипы клеток, включая морфологические изменения, происходят в ответ на экологические стимулы, но не захватываются традиционными клеточными анализами. Профилирование состояний ячеек через морфологическую характеристику и сопоставление изображений по выборкам является мощным, непредвзятым инструментом с aВозможность дать новые сведения о многих аспектах базовых и трансляционных исследований, включая базовую клеточную биологию и открытие лекарств 4 . Кроме того, морфология опухолевых клеток, как было показано, коррелирует с подтипами опухолей 5 и агрессивностью 6 . Следовательно, представляет большой интерес изучение этих клеточных признаков и их взаимосвязей с конкретными возмущениями окружающей среды. Кроме того, можно использовать различия в морфологических признаках, чтобы различать субпопуляции в системах совместной культуры. Флюоресцентно маркирующие клетки имеют падений ( т.е. изменяют присущие свойства клеток, отнимают много времени), и поэтому предпочтительными являются дополнительные методы классификации типов клеток.
Микроскопическая визуализация является альтернативным методом для профилирования клеточных фенотипов мультиплексированным, количественным и надежным способом. В этой рукописи мы применяем наш количественный контур формирования изображения, чтобы подчеркнуть эволюциюNary динамика гетерогенных клеточных популяций в опухоли. Мы фокусируемся на взаимодействии между клетками немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) и связанными с раком фибробластами (CAFs), наиболее распространенным стромальным типом клеток, обнаруженным в опухолях. CAFs участвуют в инициировании опухоли, прогрессировании и терапевтическом ответе; Поэтому проведение фенотипических анализов на опухолевые клетки в отсутствие CAF может вводить в заблуждение 7 , 8 , 9 . В частности, мы оценивали влияние CAF на опухолевые клетки в ответ на эрлотиниб, небольшую молекулу, нацеленную на рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), который часто используется при клиническом лечении НМРЛ. Для оценки мы использовали платформу для скрининга с высоким содержанием контента и ее сопутствующее программное обеспечение для анализа изображений; Однако, пытаясь сделать эту методологию доступной для других исследователей, мы также разработали сопоставимый протокол ниже по потоку с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом:CellProfiler 10 и аналитик CellProfiler 11 . Большинство анализов высокого содержания на основе изображений анализируются коммерческим программным обеспечением, специфичным для данной модели прибора. Результаты трудно тиражировать в других лабораториях с помощью другого программного обеспечения, поскольку основные алгоритмы часто являются собственностью. Измеряли использование этого контура на основе изображений, клеточной пролиферации, смерти и морфологии каждой субпопуляции гетероклеточной культуры в ответ на лекарственную терапию с использованием как флуоресцентной, так и морфологической классификации. Следующий протокол обеспечивает надежную методологию для зондирования сложных клеточных процессов.
The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features.
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately.
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations.
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была профинансирована Национальным институтом рака (NCI) грантов U54CA143798 и U54CA143907 для создания центров физических наук-онкологии (PS-OC) в Институте рака Дана-Фарбера и Университете Южной Калифорнии, соответственно. SM Mumenthaler получил награду трансляций PS-OC, которая поддерживала некоторые из этих работ.
Мы хотели бы выразить нашу глубокую благодарность нашим благотворительным сторонникам, в частности семье Стивенсона, Эммету, Тони и Тессе за их пожертвование платформы Оперетты HCS. Мы также хотели бы поблагодарить Дж. Фу за руководство и членов группы специалистов прикладной молекулярной медицины: D. Agus за клиническое руководство и наставничество, К. Патча за конструктивные обсуждения с экспериментальным дизайном, Р. Рават за помощь в протоколах анализа изображений , Дж. Кац за техническую помощь с Опереттой, П. Маклин и Д. Рудерман за полезные обсуждения и отзывы.
RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | cell culture medium |
FBS | Gemini | 100-106 | medium supplement |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | medium supplement |
TC20 | Biorad | 1450102 | cell counter |
TC20 slides with trypan blue | Biorad | 1450003 | cell counter slides |
96-well plates | Corning | 3904 | clear bottom black plates |
Erlotinib | LC Laboratories | E-4007 | |
DMSO | VWR | 317275-100ML | solution to resuspend drug |
Hoechst | Invitrogen | H21491 | nuclear dye |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | dead cell stain |
Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | whole cell stain |
Operetta high content imaging system | Perkin Elmer | ||
CellProfiler | Broad Institue | version 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
Cell culture incubator | Any cell culture incubator will be suitable – cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2. | ||
15 mL Falcon conical tubes | Falcon | 14-959-53A | |
10 cm2 cell culture plates | TPP | 93040 |