Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per studiare la dinamica della popolazione eterologica in risposta alle perturbazioni. Questo manoscritto descrive una piattaforma basata sull'immagine che produce set di dati quantitativi per la caratterizzazione simultanea di molteplici fenotipi cellulari di popolazioni eterellulari in modo robusto.
I processi cellulari sono complessi e derivano dall'interazione tra diversi tipi di cellule e il loro ambiente. Le tecniche di biologia cellulare esistenti spesso non consentono un'interpretazione accurata di questa interazione. Utilizzando un approccio quantitativo basato su imaging, presentiamo un protocollo ad alto contenuto per caratterizzare le risposte fenotipiche dinamiche ( cioè cambiamenti morfologici, proliferazione, apoptosi) di popolazioni cellulari eterogenee a cambiamenti negli stimoli ambientali. Sottolineiamo la nostra capacità di distinguere tra i tipi di cellule basati sull'intensità di fluorescenza o sulle caratteristiche morfologiche inerenti a seconda dell'applicazione. Questa piattaforma consente una caratterizzazione più completa della risposta della subpopolazione alla perturbazione, utilizzando tempi più brevi, quantità minori di reagenti e minori probabilità di errore rispetto ai test di biologia cellulare tradizionali. Tuttavia, in alcuni casi, le popolazioni cellulari possono essere difficili da identificare e quantitativamente basate su cellu complesseE richiederà ulteriori problemi di risoluzione; Sottolineiamo alcune di queste circostanze nel protocollo. Abbiamo dimostrato questa applicazione utilizzando la risposta al farmaco in un modello di cancro; Tuttavia, può essere facilmente applicato in modo più ampio ad altri processi fisiologici. Questo protocollo consente di individuare le sottopopolazioni all'interno di un sistema di co-coltura e caratterizzare la particolare risposta di ciascuno a stimoli esterni.
I dosaggi a base di cellule sono stati un cavallo di lavoro nella ricerca di base e nelle impostazioni di sviluppo dei farmaci. Tuttavia, le limitazioni di questi test standard sono diventate sempre più evidenti con la discordanza tra dati in vitro e clinici e il fallimento della maggior parte dei farmaci per ricevere l'approvazione della FDA. Qui espostiamo un nuovo metodo per l'utilizzo di immagini quantitative per analizzare contemporaneamente i fenotipi eterocellulari in risposta a rilevanti e coinvolgenti stimoli ambientali.
I saggi tradizionali basati sulle cellule che vengono utilizzati per misurare la vitalità cellulare includono: saggi di esclusione di trypan blu, MTT / MTS e colorazione a citometria a flusso di Annexin V-FITC. I test di exclusion di Trypan Blue, pur essendo semplici e poco costosi, richiedono un gran numero di celle, richiedono molto tempo e sono spesso influenzate da un orientamento dell'utente1. I test MTT e MTS misurano indirettamente la vitalità delle cellule attraverso misurazioni del tasso metabolico mitocondriale. Tuttavia, gli attivi metaboliciLe cellule possono essere influenzate da differenti condizioni di coltura (quali media o concentrazione di ossigeno) che portano a risultati imprecisi e impediscono la standardizzazione tra tipi e condizioni di cellule 2 , 3 . Un altro svantaggio importante di queste tecniche è la loro incapacità di distinguere tra tipi di cellule multiple – la maggior parte dei sistemi biologici sono eterocellulari. Mentre i metodi di citometria a flusso hanno la capacità di distinguere tra più popolazioni di celle, sono necessarie etichette di cella, il campionamento dinamico è impegnativo e, quando si utilizzano le cellule aderenti, questa applicazione diventa tempo e perde errori.
Altri importanti fenotipi cellulari, compresi i cambiamenti morfologici, si verificano in risposta a stimoli ambientali ma non sono catturati dai test tradizionali a base di cellule. Lo stato delle cellule di profilazione attraverso la caratterizzazione morfologica e la mappatura delle somiglianze tra i campioni è un potente strumento imparziale con l'aPossibilità di fornire nuovi approfondimenti in molti aspetti della ricerca di base e traslazione, inclusa la biologia delle cellule di base e la scoperta di farmaci 4 . Inoltre, la morfologia delle cellule tumorali è risultata correlata con i sottotipi del tumore 5 e l'aggressività 6 . Quindi, è di grande interesse studiare queste caratteristiche cellulari e come si riferiscono a particolari perturbazioni ambientali. Inoltre, è possibile utilizzare le differenze nelle caratteristiche morfologiche per discriminare le sottopopolazioni nei sistemi di co-coltura. Le celle di etichettatura a fluorescenza hanno dei downfalls ( vale a dire modificando le proprietà cellulari inerenti, richiedono molto tempo) e quindi metodi aggiuntivi per classificare tipi di cellule sono vantaggiosi.
L'imaging basato sulla microscopia è un metodo alternativo per profilare i fenotipi cellulari in modo multiplexato, quantitativo e robusto. In questo manoscritto appliciamo la nostra pipeline quantitativa di imaging per evidenziare l'evoluzioneDinamiche narie di popolazioni di cellule eterogenee all'interno di un tumore. Ci focalizziamo sull'interazione tra cellule non cancerose di cellule neoplastiche (NSCLC) e fibroblasti associati a cancro (CAF), il tipo di cellule stromal più diffuso nei tumori. I CAF sono stati implicati nell'iniziazione, nella progressione e nella risposta terapeutica del tumore; Pertanto, eseguire test fenotipici sulle cellule tumorali in assenza di CAF può essere fuorviante 7 , 8 , 9 . In particolare, abbiamo valutato gli effetti dei CAF sulle cellule tumorali in risposta a Erlotinib, una piccola molecola che punta sul recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) che viene spesso utilizzato nel trattamento clinico di NSCLC. Abbiamo utilizzato una piattaforma di screening ad alto contenuto e il relativo software di analisi delle immagini per la valutazione; Tuttavia, nel tentativo di rendere accessibile tale metodologia ad altri ricercatori abbiamo anche sviluppato un protocollo a valle comparabile utilizzando il software open source:CellProfiler 10 e Analizzatore CellProfiler 11 . La maggior parte dei test di screening ad alto contenuto di immagini basati su immagini vengono analizzati con software commercializzato specifico per un dato modello di strumento. I risultati sono difficili da replicare in altri laboratori con diversi software perché gli algoritmi sottostanti sono spesso proprietari. Utilizzando questa pipeline basata sull'immagine, è stata misurata la proliferazione cellulare, la morte e la morfologia di ciascuna sottopopolazione di una coltura eterologica in risposta al trattamento farmacologico utilizzando sia la classificazione basata sulla fluorescenza che sulla morfologia. Il seguente protocollo fornisce una metodologia robusta per sondare processi cellulari complessi.
The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features.
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately.
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations.
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dal National Cancer Institute (NCI) Grants U54CA143798 e U54CA143907 per istituire centri di fisica scientifica-oncologia (PS-OCs) presso l'Dana-Farber Cancer Institute e l'Università della California meridionale, rispettivamente. SM Mumenthaler ha ricevuto un premio transnetwork PS-OC che ha supportato alcuni di questi lavori.
Vorremmo esprimere la nostra più profonda gratitudine ai nostri sostenitori filantropici, in particolare alla famiglia Stephenson, Emmet, Toni e Tessa, per la donazione della piattaforma operetta HCS. Vorremmo anche ringraziare J. Foo per la guida e il Centro per i membri del team di Medicina Molecolare Applicata: D. Agus per la guida clinica e la mentorazione, K. Patsch per discussioni significative con disegno sperimentale, R. Rawat per l'aiuto nei protocolli di analisi delle immagini , J. Katz per l'assistenza tecnica con l'operetta, e P. Macklin e D. Ruderman per discussioni e feedback utili.
RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | cell culture medium |
FBS | Gemini | 100-106 | medium supplement |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | medium supplement |
TC20 | Biorad | 1450102 | cell counter |
TC20 slides with trypan blue | Biorad | 1450003 | cell counter slides |
96-well plates | Corning | 3904 | clear bottom black plates |
Erlotinib | LC Laboratories | E-4007 | |
DMSO | VWR | 317275-100ML | solution to resuspend drug |
Hoechst | Invitrogen | H21491 | nuclear dye |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | dead cell stain |
Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | whole cell stain |
Operetta high content imaging system | Perkin Elmer | ||
CellProfiler | Broad Institue | version 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
Cell culture incubator | Any cell culture incubator will be suitable – cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2. | ||
15 mL Falcon conical tubes | Falcon | 14-959-53A | |
10 cm2 cell culture plates | TPP | 93040 |