قمنا بتطوير بروتوكول جديد لدراسة الديناميات السكانية غير المتجانسة في الاستجابة للاضطرابات. تصف هذه المخطوطة منصة تعتمد على التصوير تنتج مجموعات بيانات كمية لتوصيف في وقت واحد من المظاهر الخلوية متعددة من السكان غير المتجانسة بطريقة قوية.
العمليات الخلوية معقدة وتنتج عن التفاعل بين أنواع الخلايا المتعددة وبيئتها. غالبا ما لا تسمح تقنيات البيولوجيا الخلوية الحالية بتفسير دقيق لهذا التفاعل. باستخدام نهج الكمي القائم على التصوير، نقدم بروتوكول عالية المحتوى لتوصيف الاستجابات الظاهرية الديناميكية ( أي تغيرات مورفولوجيا، وانتشار، موت الخلايا المبرمج) من السكان الخلايا غير المتجانسة للتغيرات في المحفزات البيئية. نحن نسلط الضوء على قدرتنا على التمييز بين أنواع الخلايا على أساس إما كثافة مضان أو ملامح مورفولوجيا الأصيلة اعتمادا على التطبيق. هذه المنصة تسمح لتوصيف أكثر شمولية من استجابة السكان الفرعي للاضطراب أثناء استخدام وقت أقصر، كميات صغيرة من الكواشف، وانخفاض احتمال الخطأ من المقايسات البيولوجيا الخلية التقليدية. ومع ذلك، في بعض الحالات، قد يكون من الصعب تحديد السكان الخلية و كوانتيتات على أساس الخلوية المعقدةلير وسوف تتطلب المزيد من استكشاف الأخطاء وإصلاحها. ونحن نسلط الضوء على بعض هذه الظروف في البروتوكول. علينا أن نظهر هذا التطبيق باستخدام الاستجابة للدواء في نموذج السرطان. ومع ذلك، فإنه يمكن بسهولة أن تطبق على نطاق أوسع إلى العمليات الفسيولوجية الأخرى. يسمح هذا البروتوكول واحد لتحديد الفئات السكانية الفرعية داخل نظام الثقافة المشتركة وتوصيف استجابة معينة من كل إلى المحفزات الخارجية.
وكانت المقايسات القائمة على الخلايا عاملا أساسيا في البحوث الأساسية وإعدادات المخدرات المخدرات. ومع ذلك، فإن القيود المفروضة على هذه المقايسات القياسية أصبحت واضحة على نحو متزايد مع التناقض بين في المختبر والبيانات السريرية وفشل معظم الأدوية للحصول على موافقة ادارة الاغذية والعقاقير. هنا، نقدم طريقة جديدة لاستخدام التصوير الكمي لتحليل في وقت واحد الظواهر غير المتجانسة ردا على المحفزات البيئية ذات الصلة، التي تحدث المشتركة.
المقايسات القائمة على الخلية التقليدية التي تستخدم لقياس بقاء الخلية ما يلي: المقايسات استبعاد التريبان الأزرق، مت / متس، والملحق V- فيتس تلطيخ الخلوي التدفق. تريبان المقايسات استبعاد الأزرق، في حين بسيطة وغير مكلفة، تتطلب عددا كبيرا من الخلايا، وتستغرق وقتا طويلا، وغالبا ما تتأثر التحيز المستخدم 1 . مت و المقايسات متس قياس غير مباشر بقاء الخلية من خلال قياسات معدل الأيض الميتوكوندريا. ومع ذلك، فإن النشاط الأيضيتي من الخلايا يمكن أن تتأثر ظروف الثقافة المختلفة (مثل وسائل الإعلام أو تركيز الأكسجين)، الأمر الذي يؤدي إلى نتائج غير دقيقة ويمنع التوحيد عبر أنواع الخلايا والشروط 2 ، 3 . عيب رئيسي آخر من هذه التقنيات هو عدم قدرتها على التمييز بين أنواع الخلايا متعددة – معظم النظم البيولوجية هي هيتيروسلولار. في حين أن أساليب التدفق الخلوي لديها القدرة على التمييز بين السكان خلية متعددة، مطلوب تسميات الخلية، أخذ العينات ديناميكية صعبة، وعند استخدام الخلايا الملتصقة، يصبح هذا التطبيق تستغرق وقتا طويلا والخطأ عرضة.
تحدث المظاهر الخلوية الهامة الأخرى، بما في ذلك التغيرات المورفولوجية، استجابة للمؤثرات البيئية ولكن لا يتم التقاطها بواسطة المقايسات التقليدية القائمة على الخلية. التنميط الحالات الخلية من خلال توصيف المورفولوجية ورسم خرائط أوجه التشابه عبر العينات هو أداة قوية وغير منحازة مع أبيليتي لتقديم رؤى جديدة في العديد من جوانب البحوث الأساسية والترجمة، بما في ذلك البيولوجيا الخلية الأساسية واكتشاف المخدرات 4 . وعلاوة على ذلك، وقد ثبت مورفولوجيا الخلايا السرطانية لربط مع الأنواع الفرعية الورم 5 والعدوانية 6 . وبالتالي، فمن مصلحة كبيرة لدراسة هذه الميزات الخلوية وكيفية ارتباطها الاضطرابات البيئية محددة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن استخدام الاختلافات في السمات المورفولوجية للتمييز بين المجموعات السكانية الفرعية في نظم الثقافة المشتركة. فلوريسنتلي الخلايا وضع العلامات لديه شلالات ( أي تغيير خصائص الخلايا الكامنة، تستغرق وقتا طويلا) وبالتالي أساليب إضافية لتصنيف أنواع الخلايا هي مفيدة.
التصوير القائم على الفحص المجهري هو طريقة بديلة لتحديد المظاهر الخلوية بطريقة متعددة، وكمية، وقوية. في هذه المخطوطة، نطبق خط أنابيب التصوير الكمي لتسليط الضوء على إفولوتيوديناميات ناري من السكان الخلايا غير متجانسة داخل الورم. ونحن نركز على التفاعل بين الخلايا غير الصغيرة سرطان الرئة الخلايا (نسكلك) والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (كافس)، الأكثر انتشارا نوع الخلايا اللحمية وجدت في الأورام. وقد تورط كافس في بدء الورم، والتقدم، والاستجابة العلاجية. وبالتالي، وإجراء المقايسات المظهري على الخلايا السرطانية في غياب كافس يمكن أن يكون مضللا 7 ، 8 ، 9 . على وجه التحديد، قمنا بتقييم آثار كافس على الخلايا السرطانية ردا على إرلوتينيب، وهو جزيء صغير يستهدف البشرة عامل النمو مستقبلات (إغفر) التي غالبا ما تستخدم في العلاج السريري لل نسكلك. لقد استخدمنا منصة فحص عالية المحتوى وبرامجها المصاحبة لتحليل الصور للتقييم؛ ومع ذلك، في محاولة لجعل هذه المنهجية في متناول الباحثين الآخرين وضعنا أيضا بروتوكول المصب مماثلة باستخدام البرمجيات مفتوحة المصدر:سيلبروفيلر 10 و سيلبروفيلر محلل 11 . يتم تحليل معظم المقايسات فحص عالية المحتوى القائم على صورة مع البرمجيات التجارية محددة لنموذج صك معين. النتائج يصعب تكرارها في مختبرات أخرى مع برامج مختلفة لأن الخوارزميات الكامنة غالبا ما تكون ملكية. باستخدام هذه الأنابيب القائمة على الصورة، تم قياس تكاثر الخلايا، والموت، والتشكل من كل مجموعة فرعية من ثقافة مغاير استجابة للعلاج من تعاطي المخدرات باستخدام كل من الفلورسنس والتصنيف القائم على التشكل. يوفر البروتوكول التالي منهجية قوية للبحث في العمليات الخلوية المعقدة.
The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features.
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately.
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations.
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسرطان (نسي) المنح U54CA143798 و U54CA143907 لإنشاء مراكز العلوم الفيزيائية للأورام (بس-أوكس) في معهد دانا فاربر للسرطان وجامعة جنوب كاليفورنيا، على التوالي. تلقى سم منتهالر جائزة بس-أوك ترانزيتورك التي دعمت بعض من هذا العمل.
نود أن نعرب عن عميق امتناننا للداعمين الخيرية، وخاصة عائلة ستيفنسون، ايميت، توني وتيسا، على تبرعهم من منصة أوبيريت هس. نود أيضا أن نشكر J. فو للإرشاد، ومركز أعضاء فريق الطب الجزيئي التطبيقي: D. أغوس للتوجيه والإرشاد السريري، K. باتسش للمناقشات ذات مغزى مع تصميم التجريبية، ر روات للمساعدة في بروتوكولات تحليل الصور ، J. كاتس للمساعدة التقنية مع أوبيرا، و P. ماكلين و D. روديرمان للمناقشات مفيدة وردود الفعل.
RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | cell culture medium |
FBS | Gemini | 100-106 | medium supplement |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | medium supplement |
TC20 | Biorad | 1450102 | cell counter |
TC20 slides with trypan blue | Biorad | 1450003 | cell counter slides |
96-well plates | Corning | 3904 | clear bottom black plates |
Erlotinib | LC Laboratories | E-4007 | |
DMSO | VWR | 317275-100ML | solution to resuspend drug |
Hoechst | Invitrogen | H21491 | nuclear dye |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | dead cell stain |
Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | whole cell stain |
Operetta high content imaging system | Perkin Elmer | ||
CellProfiler | Broad Institue | version 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
Cell culture incubator | Any cell culture incubator will be suitable – cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2. | ||
15 mL Falcon conical tubes | Falcon | 14-959-53A | |
10 cm2 cell culture plates | TPP | 93040 |