Combinando húmedo y Técnicas de laboratorio de simulación para guiar la cristalización de proteínas grandes que contengan espiral de la bobina
Özet
We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.
Abstract
Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are found throughout nature, however, because of their physical properties and tendency to aggregate, they are traditionally viewed as being especially difficult to crystallize. Here, we utilize a variety of quick and simple techniques designed to identify a series of possible domain boundaries for a given coiled-coil protein, and then quickly characterize the behavior of these proteins in solution. With the addition of a strongly fluorescent tag (mRuby2), protein characterization is simple and straightforward. The target protein can be readily visualized under normal lighting and can be quantified with the use of an appropriate imager. The goal is to quickly identify candidates that can be removed from the crystallization pipeline because they are unlikely to succeed, affording more time for the best candidates and fewer funds expended on proteins that do not produce crystals. This process can be iterated to incorporate information gained from initial screening efforts, can be adapted for high-throughput expression and purification procedures, and is augmented by robotic screening for crystallization.
Introduction
Determinación de la estructura a través de la cristalografía de rayos X ha hecho contribuciones fundamentales a todos los campos de la biología moderna; proporcionar una visión atómica de las macromoléculas que sostienen la vida y la forma en que interactúan unos con otros en una variedad de contextos; lo que nos permite comprender los mecanismos que causan la enfermedad y proporcionar oportunidades para el diseño racional de fármacos para tratar la enfermedad. Cristalografía ha sido durante mucho tiempo la técnica experimental dominante para la determinación de la estructura macromolecular, y en la actualidad representa el 89,3% de la base de datos estructurales (www.rcsb.org). Esta técnica tiene muchas ventajas, incluyendo el potencial de muy alta resolución, la capacidad de visualizar macromoléculas con una amplia gama de tamaños, la recopilación de datos relativamente fácil, y la oportunidad de visualizar cómo la macromolécula interactúa con disolvente, así como ligandos.
A pesar de numerosas mejoras tecnológicas en la expresión de la proteína recombinante 1,2, purification 3, y la biología molecular utilizado para generar estos sistemas 4, el mayor obstáculo en el proceso de cristalográfica sigue siendo la capacidad de crecer cristales de calidad de difracción. Esto ha sido especialmente cierto para las proteínas que contienen grandes dominios de doble arrollamiento. Se ha estimado que hasta un 5% de todos los aminoácidos se encuentran dentro de enrollado de las bobinas 5,6, haciendo de esta una característica estructural muy común 7, sin embargo, estas proteínas son a menudo más difíciles de purificar y cristalizar que las proteínas globulares 8-10 . Esto se complica aún más por el hecho de que los dominios de enrollado de la bobina se encuentran a menudo en el contexto de una proteína más grande, por lo tanto, predecir correctamente los límites de estos dominios es crítico para evitar la inclusión de la secuencia no estructurada o flexible que es a menudo perjudicial para la cristalización.
Aquí presentamos un marco conceptual basado en la web que combina computacional analiza con experil datos de la banca, para ayudar a guiar a los usuarios a través de las etapas iniciales del proceso cristalográfica incluyendo: cómo seleccionar fragmento (s) de proteínas para estudios estructurales, y la forma de preparar y caracterizar muestras de proteínas antes de los intentos de cristalización. Nos centramos nuestro análisis en dos proteínas que contienen grandes dominios de doble arrollamiento, Shroom (SHRM) y Rho-quinasa (Rock). Se eligieron estas proteínas, ya que ambos contienen dominios de doble espiral y son conocidos para formar un complejo biológicamente relevante 11-16. Hongo y Rho-quinasa (Rock) se prevé que contienen ~ 200 y 680 residuos de espiral de la bobina, respectivamente, muchas porciones de las cuales se han caracterizado estructuralmente 17-20. El método aquí descrito proporciona un flujo de trabajo optimizado para identificar rápidamente fragmentos de proteína que contiene espiral de la bobina que va a ser susceptibles para la cristalización, sin embargo, las técnicas descritas pueden ser fácilmente adaptados para la mayoría de la proteína o proteína-complejos o modificados para incorporar approa de alto rendimientoches como disponibles. Por último, estos métodos son generalmente de bajo costo y puede ser realizada por los usuarios en casi todos los niveles de experiencia.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí está diseñado para ayudar al usuario a identificar los límites de dominio dentro de las grandes proteínas espiral de la bobina para facilitar su cristalización. El protocolo se basa en una incorporación integral de una variedad de datos de predicciones computacionales y otras fuentes para generar una serie de posibles límites de dominio. Estos son seguidos por una serie de experimentos bioquímicos que son rápida y económica, y que se utilizan para perfeccionar estas hipótesis inici…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant NIH R01 GM097204 (APV and JDH). Funding for JHM was supplied by an HHMI Undergraduate Research Summer Fellowship.
Materials
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
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