Сочетание мокрой и сухой методы Lab в Руководстве по кристаллизации больших биспиральных, содержащих белки

Оборудование для определения структуры с помощью рентгеновской кристаллографии внес фундаментальный вклад в каждой области современной биологии; обеспечивая атомный вид макромолекул, которые поддерживают жизнь и как они взаимодействуют друг с другом в различных контекстах; что позволяет нам понять механизмы, которые вызывают болезни, и предоставляя возможность рационально разработать препараты для лечения болезни. Кристаллографии уже давно доминирующая экспериментальная методика определения макромолекулярной структуры, и в настоящее время составляет 89,3% от структурной базы данных (www.rcsb.org). Этот метод имеет много преимуществ, в том числе потенциал очень высокой разрешающей способности, способность визуализировать макромолекулы с широким диапазоном размеров, относительно легкого сбора данных, а также возможность представить, как макромолекула взаимодействует с растворителем, а в качестве лигандов.

Несмотря на многочисленные технологические улучшения в экспрессии рекомбинантного белка ^1,2, PURфикация ^3, и молекулярной биологии используются для создания этих систем ^4, самым большим препятствием в процессе кристаллографической остается возможность выращивать кристаллы качества дифракции. Это особенно верно для белков, которые содержат большие домены биспиральных. Было подсчитано , что почти 5% всех аминокислот найдены в пределах намотанных катушек ^5,6, что делает это очень распространенная структурная особенность ^7, но эти белки часто более трудно очистить и кристаллизуются , чем глобулярных белков ^8-10 , Это дополнительно усугубляется тем, что биспиральных домены часто встречаются в контексте более крупного белка, поэтому правильно предсказывать границы этих областей имеет решающее значение, чтобы избежать включения неструктурированной или гибкой последовательности, которая часто вредно для кристаллизации.

Здесь мы представляем концептуальную основу объединения веб-вычислительный анализ с experimentaл данные со скамейки, чтобы помочь пользователям через направляющие на начальных этапах кристаллографической процесса, включая: как выбрать фрагмент белка (ов) для структурных исследований, а также как подготовить и охарактеризовать образцы белка до попыток кристаллизации. Мы фокусируем наш анализ на двух белков, содержащих большие домены биспиральных, Shroom (ШРМ) и Rho-киназы (Rock). Эти белки были выбраны , поскольку они оба содержат домены биспиральных и , как известно, образуют биологически активные сложные ^11-16. Shroom и Rho-киназы (Rock), по прогнозам, содержат ~ 200 и 680 остатков биспиральных соответственно, многие части которых были охарактеризованы структурно ^17-20. Описанный здесь способ обеспечивает рационализировать рабочий процесс, чтобы быстро идентифицировать фрагменты биспиральных, содержащие белок, которые будут пригодны для кристаллизации, тем не менее, способы, описанные могут быть легко адаптированы для большинства белков или белковых комплексов или модифицированы включением высокой пропускной способностью approaчес как доступный. И, наконец, эти методы, как правило, недороги и могут быть выполнены пользователями практически на всех уровнях опыта.