الجمع بين الرطب وتقنيات مختبر الجافة لتوجيه بلورة البروتينات كبيرة ملفوف لفائف تحتوي على
Özet
We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.
Abstract
Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are found throughout nature, however, because of their physical properties and tendency to aggregate, they are traditionally viewed as being especially difficult to crystallize. Here, we utilize a variety of quick and simple techniques designed to identify a series of possible domain boundaries for a given coiled-coil protein, and then quickly characterize the behavior of these proteins in solution. With the addition of a strongly fluorescent tag (mRuby2), protein characterization is simple and straightforward. The target protein can be readily visualized under normal lighting and can be quantified with the use of an appropriate imager. The goal is to quickly identify candidates that can be removed from the crystallization pipeline because they are unlikely to succeed, affording more time for the best candidates and fewer funds expended on proteins that do not produce crystals. This process can be iterated to incorporate information gained from initial screening efforts, can be adapted for high-throughput expression and purification procedures, and is augmented by robotic screening for crystallization.
Introduction
جعلت تحديد هيكل عبر البلورات بالأشعة السينية مساهمات أساسية في كل ميدان من ميادين علم الأحياء الحديث. تقديم وجهة نظر الذري من الجزيئات التي تدعم الحياة وكيفية تفاعلها مع بعضها البعض في مجموعة متنوعة من السياقات. مما يتيح لنا فهم الآليات التي تسبب المرض، وتوفير فرص لتصميم بعقلانية الأدوية لعلاج المرض. وقد البلورات منذ فترة طويلة تقنية تجريبية المهيمنة لتحديد بنية الجزيئات، ويمثل في الوقت الحالي 89.3٪ من قاعدة البيانات الهيكلية (www.rcsb.org). هذه التقنية لديها العديد من المزايا، بما في ذلك القدرة على دقة عالية جدا، والقدرة على تصور الجزيئات مع مجموعة واسعة من الأحجام، وجمع البيانات بسهولة نسبيا، وإتاحة الفرصة لتصور كيف يتفاعل جزيء مع المذيبات وكذلك بروابط.
وعلى الرغم من التحسينات التكنولوجية عديدة في المؤتلف تعبير البروتين 1،2، بورification 3، والبيولوجيا الجزيئية المستخدمة لتوليد هذه الأنظمة 4، وأكبر عقبة واحدة في عملية البلورات لا تزال القدرة على بلورات نوعية الحيود. وقد كان هذا ينطبق بشكل خاص على البروتينات التي تحتوي على مجالات ملفوف لفائف كبيرة. وتشير التقديرات إلى أن ما يصل إلى 5٪ من جميع الأحماض الأمينية وجدت داخل لفائف الملفوف 5،6، مما يجعل هذا سمة هيكلية شائعة جدا 7، ولكن هذه البروتينات غالبا ما تكون أكثر صعوبة لتنقية وبلورة من البروتينات الكروية 8-10 . ومما يفاقم ذلك من حقيقة أن المجالات ملفوف لفائف وغالبا ما توجد في إطار بروتين أكبر، لذلك بشكل صحيح التنبؤ حدود هذه المجالات أمر بالغ الأهمية لتجنب إدراج تسلسل غير منظم أو مرن التي غالبا ما تكون مضرة للتبلور.
يحلل هنا نقدم الجمع بين الإطار المفاهيمي على شبكة الإنترنت الحاسوبية مع experimentaبيانات ل من على مقاعد البدلاء، لمساعدة المستخدمين على دليل من خلال المراحل الأولى من عملية البلورات بما في ذلك: كيفية تحديد جزء من البروتين (ق) للدراسات الهيكلية، وكيفية إعداد وتوصيف عينات البروتين قبل محاولات التبلور. ونحن نركز تحليلنا على اثنين من البروتينات التي تحتوي على مجالات ملفوف لفائف كبيرة، شروم (SHRM) ورو-كيناز (الصخرة). وقد تم اختيار هذه البروتينات لأن كلا منهما يحتوي على المجالات ملفوف لفائف ومعروفة لتشكيل معقد 11-16 بيولوجيا. ومن المتوقع شروم ورو-كيناز (روك) لاحتواء ~ 200 و 680 مخلفات ملفوف لفائف على التوالي، العديد من الأجزاء التي تم التعرف هيكليا 17-20. الطريقة الموصوفة هنا يوفر تبسيط العمل لتحديد أجزاء من ملفوف لفائف تحتوي على البروتين من شأنها أن تكون قابلة للتبلور بسرعة، ومع ذلك، فإن الأساليب المذكورة يمكن بسهولة أن تتكيف لمعظم البروتين أو البروتين المجمعات أو تعديل لدمج الإنتاجية العالية approaالكولينستراز المتاحة و. وأخيرا، وهذه الأساليب هي غير مكلفة عموما، ويمكن أداؤها من قبل المستخدمين في مستويات الخبرة تقريبا.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصميم البروتوكول الموصوفة هنا لمساعدة المستخدم على تحديد حدود نطاق داخل البروتينات ملفوف لفائف كبيرة لتسهيل بلورة بهم. يعتمد البروتوكول على دمج كلي من مجموعة متنوعة من البيانات من التوقعات الحسابية ومصادر أخرى لتوليد سلسلة من حدود نطاق المحتملة. هذه هي تليها مجم…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant NIH R01 GM097204 (APV and JDH). Funding for JHM was supplied by an HHMI Undergraduate Research Summer Fellowship.
Materials
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
Referanslar
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
- Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
- Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
- Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
- Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination–lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
- Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Biyoinformatik. 23 (24), 3403-3405 (2007).
- Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
- Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
- Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
- Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
- Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
- Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
- Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
- Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075 (2013).
- Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
- Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080 (2011).
- Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Jungbauer, A., Hahn, R. Ion-exchange chromatography. Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).
- Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
- Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
- Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Biyoinformatik. 25 (14), 1761-1767 (2009).
- Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
- Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
- Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
- Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).
