An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.
El conjunto canónico de aminoácidos da lugar a una gama excepcionalmente amplia de la funcionalidad de la proteína. Sin embargo, el conjunto de residuos sigue imponiendo limitaciones a las aplicaciones potenciales de proteína. La incorporación de aminoácidos no canónicos puede ampliar este ámbito. Hay dos enfoques complementarios para la incorporación de aminoácidos no canónicos. Para la incorporación específica de sitio, además de los mecanismos de traslación canónicas endógenos, un par ortogonal aminoacil-tRNA-sintetasa-ARNt debe ser siempre que no interactúa con los canónicos. En consecuencia, un codón que no está asignado a un ácido amino canónica, por lo general un codón de parada, también se requiere. Esta expansión código genético permite la incorporación de un aminoácido no canónico en un único, sitio dado dentro de la proteína. El trabajo aquí presentado describe la incorporación de residuos específico en el que el código genético es reasignado dentro del sistema de traslación endógeno. La maquinaria de traducción de unaccepts el aminoácido no canónica como un sustituto para incorporarlo en lugares prescritos canónicamente, es decir, todas las ocurrencias de un aminoácido en la proteína canónica se sustituyen por la no canónica. La incorporación de aminoácidos no canónicos puede cambiar la estructura de la proteína, haciendo que las propiedades físicas y químicas modificadas considerablemente. Análogos de aminoácidos no canónicos a menudo actúan como inhibidores del crecimiento celular para huéspedes de expresión, ya que modifican las proteínas endógenas, lo que limita tr la producción de proteínas in vivo. In vivo la incorporación de aminoácidos no canónicos tóxicos en proteínas sigue siendo particularmente difícil. A continuación, se presenta un enfoque libre de células para un reemplazo completo de la L-arginina por la no canónica aminoácido L-canavanina. Elude las dificultades inherentes a la expresión in vivo. Además, se incluye un protocolo para preparar proteínas diana para el análisis espectral de masas. Se muestra que la L-lisina se puede sustituir por hidroxi-L-lisina,aunque con menor eficiencia. En principio, cualquier análogo de aminoácido no canónica puede incorporarse utilizando el método presentado, siempre y cuando el sistema de traducción in vitro endógena reconoce.
El código genético es universal a la biosfera. Codifica para un conjunto de 20 aminoácidos canónicos, que a veces se extiende por seleniocisteína 1 o 2 pyrrolysine. Es el ribosoma que traduce el código genético con la ayuda de tRNAs en cadenas de aminoácidos que se pliegan en proteínas. Los grupos funcionales de los aminoácidos canónicos, en combinación con modificaciones postraduccionales, contribuyen a una gama excepcionalmente amplia de la función de proteínas 3,4. En principio, las limitaciones funcionales debido a la limitada serie de aminoácidos canónicos se pueden superar mediante la incorporación de más, aminoácidos canónicos (NCAA) que permiten nuevas químicas y nuevas funcionalidades 3,4.
Hay dos enfoques complementarios para la incorporación de la NCAA: sitio- o la incorporación de residuos específicos. El primer método implica considerables dificultades técnicas, ya que el conjunto canónico de aminoacil-ARNt-sintetizadoretases (aaRS) y ARNt deben ampliarse por un par ortogonal aaRs-ARNt que no debe interactuar con la maquinaria de traducción endógena. Sobre la base de la ingeniería cuidadosa, este enfoque incorpora las NCAA como mutaciones puntuales en los sitios de proteínas deseadas. La incorporación específica de sitio de NCAA está genéticamente codificado por un codón que no está asignado a un ácido amino canónica (CAA), por lo general un codón de 5-9. Este método implica cambios en la función en un centro determinado en lugar de a través de toda la proteína 10-13.
En contraste, la incorporación de residuos específica se basa en el reconocimiento erróneo del aminoácido no canónico por la maquinaria de traducción canónica. La incorporación se produce debido a la falta de especificidad de sustrato de los IAA. La incorporación de residuos específicos de la NCAA, basada en la obra de Cohen y compañeros de trabajo 14, ha dado lugar a importantes aplicaciones 3,10, entre ellos etiquetado bioortogonal 15-17 de proteínaso elucidación de la estructura de las proteínas en cristalografía de rayos X 18.
Como aaRs naturales generalmente prefieren su aminoácido relacionado sobre un NCAA isoestructural, eficiente en la incorporación vivo en residuos específicos por lo general requiere un huésped de expresión auxotrófico no es capaz de sintetizar el análogo canónica de la NCAA. Las células huésped se cultivan en medio de crecimiento que sólo entrega una baja concentración del CAA análoga. Su agotamiento en combinación con la administración de suplementos consecutiva con la NCAA obliga al huésped de expresión para incorporar la NCAA en la proteína modelo en múltiples sitios, canónicamente prescritos. En contraste con el enfoque específico del sitio, esto generalmente tiene un profundo impacto en toda la estructura de la proteína, lo que lleva a modificar considerablemente las propiedades físicas y químicas de las proteínas 19,20. Sin embargo, la mayoría de la NCAA son inhibidores de crecimiento para el huésped de expresión 3, ya que se incorporan en muchos otros proteins, además de los de interés durante la expresión de genes recombinantes. Esto limita claramente el enfoque in vivo. La incorporación in vivo de los aminoácidos que son tóxicos o que tienen fuerte influencia en la estructura de la proteína sigue siendo particularmente difícil. Sin embargo, estas moléculas se encuentran entre los más prometedores para diseñar proteínas con funciones extraordinarias.
Un ejemplo es el,, de origen natural L-canavanina noncanonical tóxico (Can), un análogo de la L-arginina (Arg). Afecta y bloques Arg caminos de reacción reguladoras y catalíticas, y su presencia en la célula viva puede conducir a la muerte inmediata 3,21-23. Su incorporación en proteínas en las posiciones de arginina puede reducir la estabilidad de la proteína 21-23. Debido a la toxicidad resultante, la expresión de canavanina que contiene proteínas en Escherichia coli (E. coli) y otros huéspedes de expresión común sigue siendo un reto. Por estas razones, completa in vivo iNCORPORACIÓN de Can en todas las posiciones Arg apropiadamente se ha confirmado una sola vez 24, utilizando un sistema de producción de una sola proteína elaborada. Sin embargo, Can ha sido propuesta como un agente anti-cáncer de 25 a 27, y como un estimulador para las enfermedades autoinmunes en humanos 28. Además, es objeto de diversos estudios sobre su anti-metabólico, antibacterianos, antifúngicos y antivirales 25. Estas propiedades plantean una demanda de eficiente y fácil de llevar a cabo los métodos de expresar Puede que contiene proteínas de farmacéuticos, médicos y estudios funcionales.
Aunque muchos de los problemas que están conectados a la producción in vivo pueden ser eludidas mediante sistemas de expresión de células libres, en los enfoques in vitro para residuos específicos solamente han sido poco explorado. Se ha informado de la incorporación de residuos específicos libre de células de un análogo de L-triptófano 29 y 30 NCAA múltiple. Estos métodos se basan en la altamente efficient T7 RNA polimerasa. La ARN polimerasa de T7 implica la transcripción del bacteriófago similar, reduciendo así la funcionalidad genética en comparación con la transcripción endógena.
La incorporación de residuos específica completa de Can en una proteína modelo en todas las posiciones Arg se informó recientemente de 31, utilizando un sistema de expresión libre de células 32. Una ligera modificación del mismo sistema permitió la incorporación específica de sitio de diferentes análogos de pyrrolysine en un modelo de proteína a través de la supresión codón de parada 33. El sistema 31 de células libres de empleado – 33 se basa en un todo E. sistema de transcripción-traducción coli. Sin embargo, se permite la expresión de proteínas tan eficientemente como en los sistemas de bacteriófagos de corriente (0,5 a 1 mg / ml de proteína recombinante) 32, al tiempo que conserva gran parte de la modularidad de transcripción-traducción original.
En este trabajo, un protocolo detallado se proporciona en la forma en la resid-ue la incorporación específica de NCAA se puede realizar, utilizando todo esto E. sistema libre de células coli 32. Además, se proponen nuevas medidas para preparar las proteínas expresadas para una evaluación apropiada a través de espectroscopia de masas HPLC-ESI. Para expandir las propiedades de este sistema libre de células, este trabajo no sólo se refiere a la incorporación de Can publicada el 31 sino que también presenta nuevos datos relacionados con la no canónica de L-lisina análogo L-hidroxi-lisina.
El siguiente protocolo para la incorporación de residuos específicos de la NCAA es una adaptación de un protocolo publicado recientemente en JoVe 34. Este último protocolo describe cómo llevar a cabo la expresión libre de células altamente eficiente con aminoácidos estándar. Además, se presenta la preparación del extracto libre de células en bruto, la solución de aminoácidos, la solución de energía stock y la memoria intermedia de energía usada en este enfoque. El siguiente protocolo se centra en pasos modificados en comparación con el anterior protocolo con el fin de permitir la incorporación de residuos específicos de la NCAA. Se recomiendan pipetas calibradas, puntas de pipeta bajo vinculante y tubos de microcentrífuga para la preparación. En lo que sigue, se usan las abreviaturas de la IUPAC para los aminoácidos.
Una herramienta fácil de usar sistema de expresión libre de células como una estrategia viable hasta el residuo específicamente incorporar NCAA en proteínas, se presentó. Con este fin, el extracto crudo se complementa con la codificación de ADN del vector para la proteína de interés, la memoria intermedia de energía y los aminoácidos correspondientes. Tenga en cuenta que el volumen de la alícuota extracto crudo depende de la concentración de proteína de extracto bruto 34. La eficacia de la expresión libre de células se optimiza en función de la concentración de la construcción de ADN vector. Los volúmenes de los componentes del tampón de energía varían en función de la optimizado Mg y las concentraciones de K-glutamato con el fin de permitir a altos rendimientos de la proteína expresada modelo libre de células.
Una evaluación preliminar del experimento incorporación se puede obtener mediante la realización de SDS-PAGE del medio de reacción libre de células no purificado. Para un análisis más detallado, espectroscopia de masas HPLC-ESI se propone como un medio para comprobar si hay incor completa, en residuos específicosporación de la NCAA. Como preparación para este último, los sistemas de columnas de centrifugado se utilizan para permitir la purificación His-tag y el intercambio de tampón con los pequeños volúmenes que utilizamos en este protocolo.
Incluyendo espectroscopia de masas HPLC-ESI, todo el protocolo se puede realizar dentro de los 2 días. No incluye ninguna medida particularmente críticas. Sin embargo, las optimizaciones de concentración de Mg y K-glutamato, así como de vector de ADN son cruciales para expresar altos rendimientos de la proteína modelo. El uso del vector de expresión altamente eficiente gene_of_model_protein-pbest-OR2-OR1-Pr-UTR1-T500 es muy recomendable. La elución de Su-etiquetados proteínas es por lo general debido a la alta concentración de imidazol (> 150 mM) y otras sales tales como NaH 2 PO 4 (> 300 mm) o NaCl (> 50 mM) que generan mucho ruido de fondo en análisis de espectroscopia de masas 49 . Intercambio de dichos tampones de elución con un tampón de almacenamiento adecuado proteína estabiliza el modelo protey reduce drásticamente el ruido de fondo durante el análisis espectroscópico de masas.
Como resultado, se puede sustituye Arg en las seis posiciones dentro de la proteína modelo. En el sistema de expresión, no hay residuos de Arg puede ser detectado. Esto simplifica la incorporación de residuos específicos de análogos de Arg en comparación con otros sistemas de expresión que requieren nuevas estrategias de agotamiento 29,30. El enfoque libre de células presentado elude las limitaciones inherentes de los métodos in vivo que se deben a la toxicidad puede, o la fuerte dependencia de la secuencia de ARNm en las estrategias de producción única de proteínas 24,31. Contrariamente a la empleada en el sistema videodan vitro, la escisión in vivo de Can a homoserina y hidroxiguanidina se produce 31.
Sin embargo, el sistema libre de células retiene una cantidad suficiente de Lys para competir con análogos tales como Hyl. El análisis HPLC-ESI espectroscópico de masas muestra que la proteína modelo contiene tanto, el Canonical así como el análogo no canónico en diferentes proporciones. La incorporación de residuos específica de Lys es posible en general, pero para la sustitución completa, más estrategias de agotamiento, o aaRs especialmente diseñados y optimizados ARNt para el reconocimiento de la NCAA necesita ser desarrollado.
Hemos logrado excelentes rendimientos de las proteínas expresadas, modelo modificados libres de células mediante la adición de la NCAA en la misma concentración que los canónicos. La eficacia de incorporación depende de la naturaleza de la NCAA a ser incorporados. Incluso los mayores rendimientos todavía podrían ser realizable mediante la optimización de la concentración de la NCAA.
Los resultados presentados demuestran la aplicabilidad del sistema empleado para la incorporación de residuos específicos de la NCAA, siempre que sean aceptados por el sistema de traslación endógena canónica. Para la incorporación de residuos específicos de la NCAA específicos, uno más tiene que comprobar si los residuos de la distur CAA análogaB, el sistema de expresión.
Sistemas de transcripción-traducción libres de células se pueden diseñar de diferentes organismos para responder a diferentes demandas 54. El totalmente E. coli mecanismos de transcripción-traducción del sistema libre de células que aquí se presenta active el uso de bacteriófago y E. promotores de E. coli, y pueden actuar en paralelo o de forma consecutiva en cascadas 55. La aplicabilidad general y la facilidad de uso hacen que el método de una herramienta potente para la investigación adicional en la toxicidad de aminoácidos y la aplicación terapéutica.
The authors have nothing to disclose.
E.G. Worst and A. Ott acknowledge financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the collaborative research center SFB 1027 as well as Saarland University. E.G. Worst, A. Ott and V. Noireaux further acknowledge financial aid by the Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). The authors thank Tobias Baumann and Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin) for critical reading.
Protective eyewear | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z758841 | |
Nitrile gloves (size S) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z768960 | Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL |
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
Microbalance Discovery DV114CM | Ohaus, Greifensee, Switzerland | 80104140 | |
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z243213 | |
L-Canavanine | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C9758 | Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves |
Hydroxylysine (racemic mixture) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H0377 | |
Cryo-gloves (size S, water resistent) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z183490 | Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany | BR1401801 | For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G) (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) |
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H6147 | |
ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8937 | |
CTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 14121 | |
GTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 16800 | |
UTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 23160 | |
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10109541001 | Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001 |
CoA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C4282 | |
NAD (from yeast ) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | N6522 | |
cAMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A9501 | |
Folinic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F7878 | |
3-PGA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8877 | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 49605 | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | G1149 | |
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 | Addgene, Cambridge, USA | Plasmid #40019 | |
4-20 % precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 81610 | |
SDS running buffer (10 x concentrate, 5000 ml) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 50001 | |
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 05002 | |
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) | New England Biolabs, Ipswich, USA | P7702S | |
Methanol | Merck, Darmstadt, Germany | 1060091011 | Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood |
Acetic acid (99.8 %) | VWR International, Darmstadt, Germany | 20104.447 | |
Coomassie Blue G-250 (10 g) | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 902120 | |
His-Spin Protein Miniprep kit | Zymo Research Europe, Freiburg, Germany | P2002 | Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA |
Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T1503 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H1758 | |
Glycerol, 99 % | VWR International, Darmstadt, Germany | 24397.296DB | |
CentriPure Z25 mini spin columns | Genaxxon bioscience, Ulm, Germany | CP-0205-Z100 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | S9888 | |
Concentrator 5301 | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5301 000.210 | |
2xYT | MP biomedicals, Santa Ana, USA | 113012032 | |
Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) | Biospec, Bartlesville, USA | 522S | |
Beads, 0.1mm dia. | Biospec, Bartlesville, USA | 11079101 | |
BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Merck, Darmstadt, Germany | 71402 | |
Bradford BSA protein assay Kit | Bio-Rad, München, Germany | 500-0201 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C1919 | |
Cuvettes, 1.5ml | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 14-955-127 | |
DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D0632 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad, München, Germany | 732-6204 | |
Nunc 384-well optical bottom plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 142761 | |
Nunc sealing tape | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 232701 | |
PEG-8000 | Promega, Madison, USA | V3011 | |
Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8584 | |
Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8709 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 66382 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 85558 | |
1L centrifuge bottle | Beckman-Coulter, Brea, USA | A98813 | |
4L Erlenmeyer flask | Kimble Chase, Vineland (NJ), USA | 26500-4000 | |
Avanti J-26XP centrifuge | Beckman-Coulter, Brea, USA | 393127 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 1 l bottles. |
Forma 480 orbital shaker | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 480 | Or shaker equivalent being able to shake chest-size 6 x 4 L . |
JLA-8.1000 rotor | Beckman-Coulter, Brea, USA | 363688 | Or 5000 x g rotor equivalent for above centrifuge equivalent being able to centrifuge 1L-bottles. |
Mini-Beadbeater-1 | Biospec, Bartlesville, USA | 3110BX | |
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge | Beckman-Coulter, Brea, USA | 368831 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes. |
Heating block HLC HBT 130 | Labexchange, Burladingen, Germany | 24465 | Or heating block equivalent being able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C |
Eppendorf MiniSpin centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5452000018 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes. |
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 – 2500 rpm) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z654760 | Or vortex equivalent |
Scotsman AF103 ice flaker machine | Kälte-Berlin, Berlin, Germany | AF103 | Or ice flaker machine equivalent |
MyTemp mini digital incubator | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z763314 | Or incubator equivalent being able to heat samples at 29 °C |
EcoCell electrophoresis cell / chamber | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | AN12005 | Or electrophoresis chamber equivalent being able to perform vertical gel electrophoresis with above precast gels or other used gels |
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | AN12001 | Or power supply equivalent being able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power |
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 | VWR International, Darmstadt, Germany | 613-5278 | Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision |
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 | VWR International, Darmstadt, Germany | 613-5279 | Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 – 10 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171101 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 – 200 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171301 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 – 1000 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171501 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) | VWR International, Darmstadt, Germany | 50-0156 | |
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) | VWR International, Darmstadt, Germany | 525-0150 | |
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 187262 | |
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 567227-U | |
Agilent 1260 HPLC machine | Agilent Technologies, Santa Clara, USA | G1312B | |
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS | Agilent Technologies, Santa Clara, USA | G6530BA | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 270717 | |
FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech, Ortenberg, Germany | 415-101 | Or microplate reader equivalent being able to measure the fluorescence of the expressed model protein |
Hanna Checker pH meter | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z351091 | |
Formic acid eluent additive for LC-MS | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 56302 |