An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.
L'ensemble canonique des acides aminés conduit à un niveau exceptionnellement large éventail de fonctionnalités de protéines. Néanmoins, l'ensemble des résidus impose encore des limitations sur les applications de protéines potentielles. L'incorporation d'acides aminés non canoniques peut élargir ce périmètre. Il existe deux approches complémentaires pour l'incorporation d'acides aminés non canoniques. Pour l'incorporation spécifique du site, en plus des mécanismes endogènes de translation canoniques, une paire aminoacyl-ARNt synthétase-ARNt orthogonal doit être prévu qui ne réagit pas avec ceux canoniques. Par conséquent, un codon qui ne soit pas affecté à un acide aminé canonique, habituellement un codon d'arrêt est également nécessaire. Cette expansion du code génétique permet l'incorporation d'un aminoacide non canonique à un seul site donné au sein de la protéine. Le travail présenté ici décrit l'incorporation spécifique de résidus où le code génétique est réaffecté au sein du système de traduction endogène. Le mécanisme de traduction d'unccepts l'acide aminé noncanonical comme un substitut pour l' incorporer à des endroits canoniquement prescrits, à savoir, toutes les occurrences d'un acide aminé dans la protéine canonique sont remplacées par une noncanonical. L'incorporation d'acides aminés non canoniques peuvent modifier la structure des protéines, ce qui provoque des propriétés physiques et chimiques considérablement modifiés. Non canoniques des analogues d'acides aminés agissent souvent comme des inhibiteurs de la croissance cellulaire pour les hôtes d'expression , car ils modifient les protéines endogènes, ce qui limite la production de protéines in vivo. In vivo incorporation d'acides aminés non canoniques toxiques dans des protéines demeure particulièrement difficile. Ici, une approche sans cellule pour un remplacement complet de L-arginine par l'acide aminé L-canavanine noncanonical est présenté. Elle contourne les difficultés inhérentes à l'expression in vivo. En outre, un protocole pour préparer des protéines cibles pour l'analyse spectrale de masse est inclus. Il est montré que la L-lysine peut être remplacée par la L-hydroxy-lysine,mais avec une efficacité moindre. En principe, tout analogue d'aminoacide non canonique peut être incorporé en utilisant la méthode présentée tant que la endogène in vitro système de traduction reconnaît.
Le code génétique est universel à la biosphère. Il code pour un ensemble de 20 acides aminés canoniques, qui est parfois prolongé par sélénocystéine 1 ou 2 pyrrolysine. Il est ribosome qui se traduit par le code génétique à l'aide d'ARNt dans des chaînes d'acides aminés qui se replient en protéines. Les groupes fonctionnels des acides aminés canoniques, en combinaison avec des modifications post – traductionnelles, contribuent à une gamme exceptionnellement large de la fonction de la protéine 3,4. En principe, les limitations fonctionnelles dues à l'ensemble limité d'acides aminés canoniques peuvent être surmontés en incorporant en outre, des acides aminés non canoniques (NCAAs) qui permettent de nouvelles chimies et de nouvelles fonctionnalités 3,4.
Il existe deux approches complémentaires pour l'incorporation de NCAAs: le site- ou l'incorporation spécifique de résidus. La première méthode implique des difficultés techniques considérables, puisque l'ensemble canonique de aminoacyl-ARNt-synthetases (RAA) et ARNt doivent être élargis par une paire aaRS-ARNt orthogonal qui ne doit pas interagir avec la machinerie de traduction endogène. Sur la base de l'ingénierie minutieuse, cette approche intègre les NCAAs que des mutations ponctuelles au niveau des sites de protéines désirées. Incorporation de NCAAs spécifique au site est génétiquement codé par un codon qui ne sont pas affectés à un acide aminé canonique (CAA), généralement un codon stop 5-9. Cette méthode implique des changements dans la fonction à un site donné , plutôt que sur l'ensemble de la protéine 10-13.
En revanche, l'incorporation spécifique au résidu repose sur la reconnaissance erronée de l'aminoacide non canonique par la machinerie de traduction canonique. L'incorporation se produit en raison de l'absence de spécificité de substrat des aaRS. L'incorporation spécifique de résidus de NCAAs, construit sur les travaux de Cohen et ses collègues 14, a conduit à d'importantes applications 3,10, entre les bio-orthogonale étiquetage 15-17 de protéinesou élucidation de la structure des protéines en cristallographie aux rayons X 18.
Comme aaRS naturels préfèrent généralement leur acide aminé apparenté sur une ncaa isostructurales, efficace in vivo incorporation spécifique de résidus nécessite généralement un hôte d'expression auxotrophe pas capable de synthétiser l'analogue canonique de la NCAA. Les cellules hôtes sont cultivées dans un milieu de croissance qui fournit seulement une faible concentration du PQA analogue. Son épuisement en combinaison avec la supplémentation consécutive avec la NCAA oblige l'hôte d'expression pour incorporer la NCAA dans la protéine de modèle à de multiples sites canoniquement prescrits. Contrairement à l'approche spécifique du site, ce qui a généralement un impact profond sur la structure de la protéine entière, conduisant à considérablement modifié les propriétés physiques et chimiques des protéines 19,20. Cependant, la plupart des NCAAs sont des inhibiteurs de croissance de l'hôte d'expression 3, car elles sont incorporées dans beaucoup d' autres proteins en plus de ceux d'intérêt au cours de l'expression du gène recombinant. Cela limite clairement l'approche in vivo. L'incorporation in vivo d'acides aminés qui sont toxiques ou qui ont une forte influence sur la structure des protéines demeure particulièrement difficile. Cependant, ces molécules sont parmi les plus prometteuses pour concevoir des protéines avec des fonctions extraordinaires.
Un exemple est la, noncanonical, naturel L-canavanine toxiques (Can), un analogue de L-arginine (Arg). Elle affecte et bloque Arg voies réactionnelles réglementaires et catalytiques associés, et sa présence dans la cellule vivante peut entraîner la mort immédiate 3,21-23. Son incorporation dans les protéines à des positions d'arginine peut réduire la stabilité des protéines 21-23. En raison de la toxicité résultant, l' expression de canavanine contenant des protéines dans Escherichia coli (E. coli) et d' autres hôtes d'expression commune reste un défi. Pour ces raisons, complète in vivo incorporation de Can à toutes les positions Arg a été confirmée de manière appropriée une seule fois 24, en utilisant un système de production unique protéine élaborée. Cependant, Can a été proposée comme un agent anti-cancer 25-27, et comme un stimulateur pour les maladies auto – immunes chez les humains 28. En outre, il fait l' objet de diverses études sur ses propriétés anti-métabolique, antibactériens, antifongiques et antivirales 25. Ces propriétés soulèvent une demande pour efficace et facile à exécuter des méthodes pour exprimer Peut contenant des protéines pour pharmacie, médicaux et des études fonctionnelles.
Bien que de nombreux problèmes qui sont liés à la production in vivo peuvent être contournés en utilisant des systèmes d'expression sans cellules, dans les approches in vitro spécifiques de résidus ont seulement été mal exploré. L'incorporation sans cellules spécifiques reste d'un L-tryptophane analogique 29 et multiple NCAAs 30 ont été rapportés. Ces méthodes sont basées sur la très efficpolymérase ient T7 RNA. La T7 ARN polymérase du bactériophage comporte en forme de transcription, ce qui réduit la fonctionnalité génétique par rapport à la transcription endogène.
L'incorporation spécifique du résidu complet de Can dans une protéine de modèle à toutes les positions Arg a été récemment rapporté 31, en utilisant un système d'expression sans cellule 32. Une légère modification du même système a permis l' incorporation spécifique du site de différents analogues de pyrrolysine dans une protéine modèle via codon stop suppression 33. Le système exempt de cellules utilisé 31 – 33 est basé sur un ensemble E. coli système de transcription-traduction. Néanmoins, il permet l' expression des protéines aussi efficacement que dans les systèmes de bactériophage courant (0,5 à 1 mg / ml de protéine recombinante) 32 tout en conservant une grande partie de la modularité originale de transcription-traduction.
Dans ce travail, un protocole détaillé est fourni sur la manière dont le résidincorporation spécifique de NCAAs-ue peut être réalisée en utilisant tout cela E. système sans cellule coli 32. En outre, de nouvelles mesures pour préparer les protéines exprimées pour une évaluation appropriée par spectroscopie de masse HPLC-ESI sont proposées. Pour développer les propriétés de ce système sans cellule, ce travail ne se réfère pas seulement à l'incorporation publiée de Can 31 , mais présente également de nouvelles données relatives à la L-lysine analogique L-hydroxy-lysine noncanonical.
Le protocole suivant pour l'incorporation spécifique du résidu d'NCAAs est une adaptation d'un protocole publié récemment dans JoVE 34. Le dernier protocole décrit comment effectuer l'expression sans cellule très efficace avec des acides aminés standard. En outre, il présente la préparation de l'extrait exempt de cellules brut, la solution d'acide aminé, la solution d'énergie de stock et le tampon de l'énergie utilisée dans cette approche. Le protocole qui suit se concentre sur les étapes modifiées par rapport à la précédente protocol afin de permettre l'incorporation spécifique de résidus de NCAAs. pipettes étalonnées, conseils faible liaison pipettes et tubes micro-centrifugeuse sont recommandées pour la préparation. Dans ce qui suit, les abréviations IUPAC pour les acides aminés sont utilisés.
Un facile à utiliser le système d'expression sans cellule comme une stratégie viable au résidu spécifiquement incorporer NCAAs en protéines, est présenté. A cet effet, l'extrait brut est complété par de l'ADN codant vecteur pour la protéine d'intérêt, le tampon d'énergie et les acides aminés correspondants. A noter que le volume de l' aliquote de l' extrait brut dépend de l'extrait brut de la concentration en protéines 34. L'efficacité d'expression acellulaire est optimisée en fonction de la concentration de la construction d'ADN de vecteur. Les volumes des composants tampons d'énergie varie en fonction de la concentration optimale de Mg et K-glutamate afin de permettre à des rendements élevés de la protéine exprimée modèle acellulaire.
Une évaluation préliminaire de l'expérience d'incorporation peut être obtenue en effectuant une SDS-PAGE du milieu réactionnel acellulaire non purifié. Pour une analyse plus détaillée, la spectroscopie de masse HPLC-ESI est proposé comme un moyen pour vérifier complète, incor spécifique de résidusporation de la NCAA. Comme préparation pour ces derniers, les systèmes de colonnes de spin sont utilisés pour permettre His-tag purification et échange de tampon avec les petits volumes que nous utilisons dans ce protocole.
Y compris la spectroscopie de masse HPLC-ESI le protocole entier peut être effectuée dans les 2 jours. Il ne comprend pas les étapes particulièrement critiques. Cependant, les optimisations de concentration de Mg et K-glutamate, ainsi que du vecteur ADN sont cruciales afin d'exprimer des rendements élevés de la protéine modèle. L'utilisation du vecteur d'expression très efficace pBEST-OR2-Or1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 est fortement recommandé. Elution de marquage His protéines est généralement due à une forte concentration d'imidazole (> 150 mM) et d' autres sels tels que NaH 2 PO 4 (> 300 mM) ou NaCl (> 50 mM) qui génèrent un bruit de fond élevé dans la masse analyse spectroscopique 49 . L'échange de ces tampons d'élution avec un tampon de stockage de protéine appropriée stabilise le modèle proteet considérablement réduit le bruit de fond lors de l'analyse par spectroscopie de masse.
Par conséquent, Can remplace Arg à six positions dans la protéine modèle. Dans le système d'expression, pas de résidus Arg peuvent être détectés. Cela simplifie l'incorporation spécifique de résidus d'analogues Arg par rapport à d' autres systèmes d'expression qui nécessitent de nouvelles stratégies d'épuisement 29,30. L'approche sans cellule présentée contourne les limites inhérentes aux approches in vivo qui sont dues à la toxicité Can ou une forte dépendance à l' égard séquence d'ARNm dans les stratégies 24,31 de production de protéines unique. Contrairement à l'emploi dans le système videodan vitro, le clivage in vivo de Can à homosérine et hydroxyguanidine ne se produit 31.
Cependant, le système acellulaire conserve une quantité suffisante de Lys en concurrence avec des analogues tels que Hyl. L'analyse par HPLC-ESI spectrométrie de masse montre que la protéine modèle contient à la fois, le canonical ainsi que l'analogue non canonique dans des proportions différentes. L'incorporation spécifique du résidu de Lys est possible en général, mais pour une substitution complète, de nouvelles stratégies d'épuisement, ou aaRS spécialement conçus et ARNt optimisé pour la reconnaissance de NCAAs doivent être développées.
Nous avons obtenu d'excellents rendements exprimés protéines modèles exempts de cellules, modifiées en ajoutant la NCAA à la même concentration que ceux canoniques. L'efficacité d'incorporation dépend de la nature de la ncaa à incorporer. Même les rendements plus élevés pourraient encore être réalisables en optimisant la concentration du ncaa.
Les résultats présentés démontrent l'applicabilité du système utilisé pour l'incorporation spécifique de résidus de NCAAs aussi longtemps qu'ils sont acceptés par le système de translation endogène canonique. Pour l'incorporation spécifique de résidus de NCAAs spécifiques, un des besoins supplémentaires pour vérifier si les résidus de la cAA perturba analogueb le système d'expression.
Systèmes de transcription-traduction exempts de cellules peuvent être conçus à partir de différents organismes pour répondre aux différentes demandes 54. Le tout E. coli transcription-traduction machineries du système sans cellule présentée ici permettent l'utilisation de bactériophages et E. promoteurs coli, et ils peuvent agir en parallèle ou consécutivement en cascades 55. L'applicabilité générale et la facilité d'utilisation font de la méthode, un outil puissant pour la recherche dans la toxicité des acides aminés et de l'application thérapeutique.
The authors have nothing to disclose.
E.G. Worst and A. Ott acknowledge financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the collaborative research center SFB 1027 as well as Saarland University. E.G. Worst, A. Ott and V. Noireaux further acknowledge financial aid by the Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). The authors thank Tobias Baumann and Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin) for critical reading.
Protective eyewear | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z758841 | |
Nitrile gloves (size S) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z768960 | Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL |
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
Microbalance Discovery DV114CM | Ohaus, Greifensee, Switzerland | 80104140 | |
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z243213 | |
L-Canavanine | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C9758 | Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves |
Hydroxylysine (racemic mixture) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H0377 | |
Cryo-gloves (size S, water resistent) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z183490 | Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany | BR1401801 | For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G) (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) |
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H6147 | |
ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8937 | |
CTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 14121 | |
GTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 16800 | |
UTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 23160 | |
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10109541001 | Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001 |
CoA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C4282 | |
NAD (from yeast ) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | N6522 | |
cAMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A9501 | |
Folinic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F7878 | |
3-PGA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8877 | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 49605 | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | G1149 | |
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 | Addgene, Cambridge, USA | Plasmid #40019 | |
4-20 % precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 81610 | |
SDS running buffer (10 x concentrate, 5000 ml) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 50001 | |
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 05002 | |
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) | New England Biolabs, Ipswich, USA | P7702S | |
Methanol | Merck, Darmstadt, Germany | 1060091011 | Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood |
Acetic acid (99.8 %) | VWR International, Darmstadt, Germany | 20104.447 | |
Coomassie Blue G-250 (10 g) | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 902120 | |
His-Spin Protein Miniprep kit | Zymo Research Europe, Freiburg, Germany | P2002 | Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA |
Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T1503 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H1758 | |
Glycerol, 99 % | VWR International, Darmstadt, Germany | 24397.296DB | |
CentriPure Z25 mini spin columns | Genaxxon bioscience, Ulm, Germany | CP-0205-Z100 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | S9888 | |
Concentrator 5301 | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5301 000.210 | |
2xYT | MP biomedicals, Santa Ana, USA | 113012032 | |
Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) | Biospec, Bartlesville, USA | 522S | |
Beads, 0.1mm dia. | Biospec, Bartlesville, USA | 11079101 | |
BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Merck, Darmstadt, Germany | 71402 | |
Bradford BSA protein assay Kit | Bio-Rad, München, Germany | 500-0201 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C1919 | |
Cuvettes, 1.5ml | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 14-955-127 | |
DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D0632 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad, München, Germany | 732-6204 | |
Nunc 384-well optical bottom plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 142761 | |
Nunc sealing tape | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 232701 | |
PEG-8000 | Promega, Madison, USA | V3011 | |
Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8584 | |
Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8709 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 66382 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 85558 | |
1L centrifuge bottle | Beckman-Coulter, Brea, USA | A98813 | |
4L Erlenmeyer flask | Kimble Chase, Vineland (NJ), USA | 26500-4000 | |
Avanti J-26XP centrifuge | Beckman-Coulter, Brea, USA | 393127 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 1 l bottles. |
Forma 480 orbital shaker | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 480 | Or shaker equivalent being able to shake chest-size 6 x 4 L . |
JLA-8.1000 rotor | Beckman-Coulter, Brea, USA | 363688 | Or 5000 x g rotor equivalent for above centrifuge equivalent being able to centrifuge 1L-bottles. |
Mini-Beadbeater-1 | Biospec, Bartlesville, USA | 3110BX | |
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge | Beckman-Coulter, Brea, USA | 368831 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes. |
Heating block HLC HBT 130 | Labexchange, Burladingen, Germany | 24465 | Or heating block equivalent being able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C |
Eppendorf MiniSpin centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5452000018 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes. |
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 – 2500 rpm) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z654760 | Or vortex equivalent |
Scotsman AF103 ice flaker machine | Kälte-Berlin, Berlin, Germany | AF103 | Or ice flaker machine equivalent |
MyTemp mini digital incubator | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z763314 | Or incubator equivalent being able to heat samples at 29 °C |
EcoCell electrophoresis cell / chamber | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | AN12005 | Or electrophoresis chamber equivalent being able to perform vertical gel electrophoresis with above precast gels or other used gels |
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | AN12001 | Or power supply equivalent being able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power |
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 | VWR International, Darmstadt, Germany | 613-5278 | Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision |
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 | VWR International, Darmstadt, Germany | 613-5279 | Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 – 10 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171101 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 – 200 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171301 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 – 1000 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171501 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) | VWR International, Darmstadt, Germany | 50-0156 | |
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) | VWR International, Darmstadt, Germany | 525-0150 | |
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 187262 | |
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 567227-U | |
Agilent 1260 HPLC machine | Agilent Technologies, Santa Clara, USA | G1312B | |
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS | Agilent Technologies, Santa Clara, USA | G6530BA | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 270717 | |
FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech, Ortenberg, Germany | 415-101 | Or microplate reader equivalent being able to measure the fluorescence of the expressed model protein |
Hanna Checker pH meter | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z351091 | |
Formic acid eluent additive for LC-MS | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 56302 |